高糖、高胰岛素及二甲双胍对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响*

孙启天，高 宇，刘晓燕，贺晓磊，邢恩鸿，孙立新

(1.承德医学院，河北承德 067000; 2.承德医学院附属医院)

基础医学

高糖、高胰岛素及二甲双胍对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响*

孙启天1，高 宇2△，刘晓燕2，贺晓磊2，邢恩鸿2，孙立新2

(1.承德医学院，河北承德 067000; 2.承德医学院附属医院)

目的:探讨高糖、高胰岛素和不同浓度二甲双胍对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法:体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7，分别给予高糖和(或)高胰岛素及不同浓度的二甲双胍进行干预，MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况。结果:高糖、高胰岛素、高糖高胰岛素作用不同时间均可促进MCF-7细胞增殖;不同浓度的二甲双胍干预后，MCF-7细胞的生长均受到一定程度的抑制，且随时间和浓度的增加而增加。结论:不同浓度二甲双胍可对高糖、高胰岛素作用下乳腺癌MCF-7细胞的增殖起到抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。

MCF-7细胞;葡萄糖;胰岛素;二甲双胍;细胞增殖

近年的研究发现，2型糖尿病可以导致多种肿瘤的发生、发展并影响肿瘤患者的存活率。流行病学调查显示，降糖药物二甲双胍可以降低糖尿病患者肿瘤的发生率[1]。女性45-49岁、60-64岁是乳腺癌的高发阶段，患有糖尿病的女性更易患乳腺癌。并且，乳腺癌合并2型糖尿病是乳腺癌复发和转移的独立预后危险因素，但机制不明。本研究应用高糖和高胰岛素体外处理人乳腺癌MCF-7细胞，模拟糖尿病患者的体内环境，探讨二甲双胍对MCF-7细胞体外增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 方法

1.2.1 细胞培养:使用含10%血清的低糖培养液培养MCF-7细胞，于37℃、5% CO2、饱和湿度无菌细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组:细胞分为普通组、高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组。其中，普通组葡萄糖浓度为5mmol/ L、胰岛素浓度为0mU/L，高糖组葡萄糖浓度为20mmol/ L、胰岛素浓度为0mU/L，高胰岛素组葡萄糖浓度为5mmol/L、胰岛素浓度为125mU/L，高糖高胰岛素组葡萄糖浓度为20mmol/L、胰岛素浓度为125mU/L;以普通组作为普通对照组。另外，分别用浓度为0、2.5、5、10、20mmol/L的二甲双胍干预各组细胞，其中，以二甲双胍浓度为0mmol/L的干预组为干预对照组。

1.2.3 MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况:收集对数期MCF-7细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μl接种于96孔板，每孔细胞密度为1500/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。5% CO2、37℃孵育至细胞贴壁，吸出培养液，按照上述分组分别加入葡萄糖、胰岛素及不同浓度的二甲双胍。孵育12h、24h、48h后每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床上低速震荡10min，使结晶充分溶解，使用酶联免疫检测仪于波长490nm处测量各孔的吸光值，实验重复3次。细胞增殖抑制率=(干预对照组OD值-实验组OD值)/干预对照组OD值×100%。细胞增殖率=实验组OD值/普通对照组OD值×100%。

1.3 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，两组间比较采用独立样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 作用不同时间MCF-7细胞的增殖情况 高糖作用24h、48h MCF-7细胞的增殖率虽然高于普通对照组，但差异无统计学意义;高糖作用72h MCF-7细胞的增殖率明显高于普通对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。高胰岛素、高糖高胰岛素作用24h、48h、72h MCF-7细胞的增殖率均明显高于普通对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);但高糖、高胰岛素作用同时间点，MCF-7细胞增殖率比较差异无统计学意义。与高糖作用同时间点比较，高胰岛素、高糖高胰岛素作用24h、48h、72h MCF-7细胞的增殖率均明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 作用不同时间各组MCF-7细胞的增殖情况(%，±s)

表1 作用不同时间各组MCF-7细胞的增殖情况(%，±s)

与普通对照组相比:*P＜0.05;与高糖组同时间点比较:△P＜0.05

组别 2 4 h 4 8 h 7 2 h普通对照组 1 0 0 . 0 0 ± 1 9 . 6 3 1 0 0 . 0 0 ± 1 0 . 6 2 1 0 0 . 0 0 ± 2 0 . 0 8高糖组 1 0 6 . 9 2 ± 5 . 6 0 1 2 2 . 6 3 ± 1 7 . 5 8 3 1 3 9 . 7 8 ± 1 1 . 7 0*高胰岛素组 1 3 0 . 0 4 ± 8 . 1 0△ 1 5 7 . 3 9 ± 4 . 6 7△ 1 7 4 . 1 8 ± 3 7 . 2△ 高糖高胰岛素组 1 3 8 . 4 1 ± 1 2 . 7 0△ 1 5 7 . 7 1 ± 1 3 . 7 0△ 1 9 9 . 9 4 ± 2 7 . 3 1△

2.2 不同浓度二甲双胍作用不同时间对MCF-7细胞的抑制作用 不同浓度二甲双胍干预后，除干预对照组(0mmol/L)，其它二甲双胍干预组MCF-7细胞的生长均受到一定程度的抑制，且随时间及浓度的增加而增加，呈时间和浓度依赖性。见表2。

表2 不同浓度二甲双胍作用不同时间MCF-7细胞增殖抑制率(%，±s)

表2 不同浓度二甲双胍作用不同时间MCF-7细胞增殖抑制率(%，±s)

①不同浓度二甲双胍作用相同时间比较:与干预对照组相比，aP＜0.05;与2.5mmol/L二甲双胍组相比，bP＜0.05;与5mmol/L二甲双胍组相比，cP＜0.05;与10mmol/L二甲双胍组相比，dP＜0.05。②相同浓度二甲双胍作用不同时间比较:与24h相比，eP＜0.05;与48h相比，fP＜0.05。

组别和作用时间 二甲双胍( m m o l / L )干预对照组( 0 m m o l / L ) 2 . 5 5 1 0 2 0 2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 8 9 ± 0 . 9 1 1 2 . 4 7 ± 3 . 1 5ab 2 7 . 2 7 ± 1 1 . 9 7abc3 5 . 5 2 ± 2 . 8 5abcd普通组 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 6 . 0 9 ± 2 . 4 2a 1 3 . 9 ± 2 . 7 4a 3 2 . 0 7 ± 5 . 9 5abc4 3 . 9 7 ± 3 . 8 5abcd7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 7 . 0 5 ± 1 . 8 5a 1 7 . 6 6 ± 4 . 3 0abe 4 1 . 2 2 ± 8 . 4 6abce6 0 . 9 8 ± 5 . 1 2abcef2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 0 8 ± 0 . 6 2 9 . 8 7 ± 1 . 6 0ab 2 1 . 0 6 ± 5 . 0 5abc3 2 . 2 0 ± 1 . 9 1abcd高糖组 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 6 . 7 2 ± 4 . 1 4 1 3 . 9 9 ± 5 . 1 4ab 2 9 . 2 0 ± 5 . 6 2abce4 6．8 ± 5 . 5 8abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 8 . 9 7 ± 2 . 9 0a 2 0 . 3 5 ± 5 . 6 8abeb 3 4 . 6 3 ± 3 . 4 3abcef5 3 . 0 8 ± 4 . 1 6abcd2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 7 5 ± 1 . 0 6 1 1 . 2 6 ± 2 . 4 0ab 2 6 . 7 8 ± 3 . 2 1abc3 7 . 7 8 ± 6 . 3 3abcd高胰岛素组 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 . 9 3 ± 0 . 8 9 1 2 . 9 4 ± 2 . 3 0ab 2 7 . 2 6 ± 6 . 7 0abc4 5 . 3 4 ± 4 . 0 4abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 7 4 ± 1 . 4 8a 1 7 . 8 3 ± 7 . 9 0ab 3 2 . 0 2 ± 5 . 2 0abc5 4 . 2 5 ± 6 . 6 3abcdef2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 8 7 ± 0 . 4 5 1 1 . 2 0 ± 2 . 4 8ab 2 2 . 6 8 ± 3 . 4 7abc3 8 . 4 1 ± 2 . 2 3abcd高糖高胰岛素组 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 . 1 8 ± 1 . 9 3 1 1 . 4 0 ± 1 . 4 4ab 3 0 . 9 5 ± 4 . 0 5abce4 7 . 9 5 ± 4 . 4 0abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 2 8 ± 1 . 8 8a 1 6 . 0 2 ± 5 . 3 6ab 3 4 . 4 5 ± 8 . 4 3abcef5 1 . 3 5 ± 8 . 1 1abcdef

3 讨论

近年来多项研究已经证实糖尿病患者肿瘤的发生率增高，高糖和高胰岛素经常同时出现于2型糖尿病患者，因此很难区分二者与肿瘤的具体关系。人们普遍认为高血糖可使肿瘤的发生率增高，但最近的一项研究显示，糖化血红蛋白较低且严格控制血糖的患者与高糖化血红蛋白的患者肿瘤发生率比较并无差异，因此认为高血糖与肿瘤发生的关系并不密切[2]。此外，有一些研究发现胰岛素与肿瘤的发生无关[3-4]。与此相反，有流行病学调查显示，高胰岛素水平的绝经后非糖尿病女性患乳腺癌的风险较高，提示高胰岛素与乳腺癌的发生有关[5]。本研究发现，高糖作用72h才对乳腺癌MCF-7细胞的增殖率有所影响，而高胰岛素和高糖+高胰岛素作用24h MCF-7细胞的增殖率就明显升高，说明胰岛素对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响更为敏感。胰岛素促肿瘤生长的可能机制包括激活胰岛素受体及胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)，进而促进细胞的有丝分裂，发挥抗细胞凋亡的作用;另外，胰岛素还可降低IGF-1结合蛋白的水平，导致游离IGF-1的数量增加，使IGF-1和IGF-1R的结合增加，进而加强IGF-1的促肿瘤生长作用[6]。

本研究还发现，不同浓度二甲双胍可对高糖、高胰岛素作用下乳腺癌MCF-7细胞的增殖起到抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。二甲双胍是2型糖尿病的一线用药，流行病学调查显示，二甲双胍可以降低糖尿病患者多种肿瘤的发病率，其抑制肿瘤可能包括多种机制，如抑制肝糖输出、增强胰岛素敏感性、降低循环中胰岛素的水平等[7]。Libby等[8]认为，二甲双胍对肿瘤的抑制作用与用药剂量相关，本研究也证实了这一点。

但本研究中使用的二甲双胍浓度(2.5-20mmol/L)远高于二甲双胍的临床用药浓度(10-40μmol/L)。有研究提示，浓度小于1mmol/L的二甲双胍对肿瘤细胞的增殖并无抑制作用[9-10]。因此，对于临床应用二甲双胍与肿瘤的关系，仍需进一步研究证明。

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EFFECTS OF HIGH GLUCOSE, HIGH INSULIN AND METFORMIN ON PROLIFERATION OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINE MCF-7

SUN Qi-tian, GAO Yu, LIU Xiao-yan, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of high glucose, high insulin and different concentration metformin on proliferation of breast cancer cell line MCF-7.Methods:MTT method was used to detect the proliferation of MCF-7 cells after the MCF-7 cells were intervened by high glucose and/or high insulin and different concentration of metformin in vivo.Results:High glucose and/or high insulin could promote proliferation of MCF-7 cells at different action time. After intervened by different concentration of metformin, the growth of MCF-7 was inhibited to a certain extent which increased with time and concentration.Conclusions: Different concentration of metformin can inhibit proliferation of MCF-7 cells under the action of high glucose and high insulin, which shows time and the concentration dependence.

MCF-7 cells; Glucose; Insulin; Metformin; Cell proliferation

R737.9

A

1004-6879(2014)01-0001-03

2013-07-21)

* 承德市科学技术研究与发展计划项目(201121030)

△ 通讯作者