临床实验室检测方法空白限、检出限和定量限评价新方法

卫生部北京医院卫生部临床检验中心（100730） 康凤凤 王 薇 王治国

临床实验室检测方法空白限、检出限和定量限评价新方法

卫生部北京医院卫生部临床检验中心（100730） 康凤凤 王 薇 王治国△

临床实验室检测方法的下限性能是非常关键的，尤其是当分析物在低浓度水平有重要临床意义时。最早采用术语“分析灵敏度”，即可检测的最低分析物浓度，该定义仅基于空白样本的重复试验。同时出现的另一术语为“功能性灵敏度”，即测量程序长期不精密度（coefficient of variation，CV）为20%时对应的浓度水平，该定义基于精密度分布图。2004年，美国临床和实验室标准化研究院（CLSI）颁布了EP17-A文件：检出限和定量限的测定方案；批准指南［1］；2012年6月，CLSI又颁布了EP17-A2文件：临床实验室测量程序检测能力评价；批准指南（第二版）［2］。由于“分析灵敏度”与术语“检出限”或“检测下限”在一定程度上可互换，而“功能性灵敏度”又易与术语“临床灵敏度”、“阈值”等混淆，因此这两个文件推荐了新的术语描述检测下限性能：空白限（limit of blank，LoB）、检出限（lim it of detection，LoD）和定量限（limit of quantitation，LoQ）。LoB定义为空白样本的系列结果中的最大值；LoD定义为方法可检出的最低被测物浓度；LoQ定义为能可靠检出分析物且检测结果的不确定度满足实验室既定目标的实际浓度。

目前，检测下限性能评价方法主要为EP17-A指南推荐的经典法，但该方法仅适用于定量检测方法，要求数据具有方差齐性。最新颁布的EP17-A2指南提出了两种新的方法：精密度分布图和概率单位法（probit法）。本文将结合具体实例，探讨临床实验室如何使用这3种方法建立LoB，LoD和LoQ。

空白限和检出限

1.经典法

该方法由EP17-A文件中提出，要求各低浓度样本的测量结果具有方差齐性。LoB由空白样本的结果确定，检测结果高于该值为真正空白样本的可能性很小。此处可能犯Ⅰ类错误，即真正空白样本错误判断为阳性样本，其风险为α。相反，真正低浓度样本可能被错误判断为阴性样本，即犯Ⅱ类错误，相关风险为β。实际应用中，通常假设α＝β＝0.05，临床实验室可根据特定测量程序确定合理的α和β。

（1）研究设计 以雌二醇免疫法测量程序为例，默认α＝β＝0.05。空白样本来源健康人群血清标本，利用免疫吸附法去除内源性雌二醇。利用浓度为0 pg/m l的校准品对其进行重复性研究（n＝20）。测量结果的最大值为7pg/m l，以此作为LoB初始估计值，并确定低浓度样本的期望范围为7～35pg/m l（LoB的1～5倍）。选择5个空白样本和5个低浓度样本，分别用两个批号的试剂对各个标本重复检测，每天重复检测4次，连续检测3天，最终每个试剂批号分别有60个空白结果和低浓度结果。

（2）数据分析

①LoB估计 采用非参数方式计算LoB［3］：

1）将60个空白样本的检测结果按从小到大的方式进行排序；

2）α＝0.05，计算空白样本结果分布的百分位数（Pct），即Pct＝0.95；

3）根据Pct计算空白样本的排列位置，即排列位置＝0.5＋60×0.95＝57.5。排列位置必须是整数，应根据第57和58位的结果进行计算，LoB＝X57＋0.5（X58-X57）。两个批号试剂对应的LoB估计值分别为7.6pg/m l和9.4pg/m l。将两个批号的较大值作为最终的LoB估计值，即9.4pg/m l。注意如果研究包含4个或以上的试剂批号，可直接用所有数据按步骤1）～3）计算LoB，因为4个以上的试剂批号已很大程度降低了批间变异。

②LoD估计 LoD估计多采用参数分析法，如果低浓度样本测量结果不具方差齐性，可采用非参数分析法或下文的精密度分布图。

1）分别对每个试剂批号的每个低浓度样本计算标准差（si）；

2）计算每个试剂批号的J个低浓度样本的总标准差（sL）

（si为第i个低浓度样本所有结果的标准差，ni为第i个低浓度样本所有结果数，J为低浓度样本数）；

3）计算LoD：LoD＝LoB＋cpsL，cp＝为正态分布95百分位数的乘数因子，L为所有试剂批号所有低浓度样本结果总数；

4）计算过程与结果如表1所示，两个批号的LoD估计值分别为14.5pg/m l和13.8 pg/m l，取较大的14.5 pg/m l作为测量程序的最终LoD估计值。

表1 LoD估计（单位pg/m l）

2.精密度分布图

精密度分布图是以系列浓度水平为横坐标，以浓度水平相应的不精密度为纵坐标的函数关系曲线，表示分析系统对不同浓度样本的精密度差异。该方法仅用于LoD的测定，尤其适用于测量结果在假定LoD附近的变异很大，或者临床实验室未对LoD进行明确估计，期望获得更宽的测量浓度范围［4］。精密度分布图最早用于功能性灵敏度的测定，后来逐渐发展成为一模型，用于其他分析物，如甲状腺激素、前列腺特异性抗原（prostatic specific antigen，PSA）等。

（1）研究设计 以PSA免疫学试验为例，初步精密度试验显示该测量程序变异性随着分析物浓度增加而增大，采用精密度分布图评价LoD。利用免疫吸附法去除血清样本中的内源性分析物作为空白样本，经典法计算LoB估计值为0.51ng/m l。选择至少5个低浓度样本，每天分别用两个批号的试剂对各个标本重复检测5次，连续检测5天。

（2）数据分析

①按照CLSIEP05文件中描述的方法，计算各样本的均值和实验室内精密度（sWL）的估计值［5］，如表2所示；

②选择合适的模型拟合精密度分布图数据，初步观察该曲线为二阶多项式，利用excel执行多项式模型回归：sWL＝0.3741＋0.0149X＋0.0055X2（批号1），sWL＝0.2801＋0.0817X＋0.0017X2（批号2），精密度分布图见图1；

③从LoB分析物浓度开始，根据精密度分布图模型计算预期实验室内精密度（sWL），按公式计算LoD：LoD＝LoB＋cpsWL，计算cp＝1.646。LoD＝0.51＋ 1.646×（0.3741＋0.0149×0.51＋0.0055×0.512）＝1.14（批号1），LoD＝0.51＋1.646×（0.2801＋0.0817 ×0.51＋0.0071×0.512）＝1.047（批号2）。批号1和批号2的LoD估计值都不等于起始分析物浓度0.51ng/m l，因此从0.50 ng/m l开始，每次增加0.1，逐渐增加分析物浓度，计算预期sWL及相关的LoD，直到得到一个拟合的LoD估计值的分析物浓度；

④选择两个批号中较大者作为最终的LoD估计值，报告该测量程序的LoD为1.16ng/m l。。

表2 各样本测量均值和实验室内变异（单位ng/m l）

图1 两个试剂批号的精密度分布图

3.概率单位法（probit法）

该方法适用于当测量程序的检测能力以比例（阳性结果数/重复检测的总数）的形式表示时，最早应用于杀虫效率的评价，目前已广泛用于其他领域中［6-7］。典型的probit法遵循有限稀释的剂量-反应方案，即从已知测量浓度的样本开始作一系列稀释，然后测量程序对这些稀释物进行重复检测，得到两种结果：检出或未检出。对每个稀释浓度，计算“检出”测量结果数/总的重复测量数的比例（命中率）。将这些命中率转化为累积正态概率单位，并用回归模型对各自的测量浓度进行修匀。最后用回归模型计算预期命中率（如0.95）的测量浓度，即LoD。该方法尤其适用于分子检测或其他利用PCR技术进行扩增和检测的测量程序，其没有阴性样本结果的分布，LoB通常报告为0。

（1）研究设计 以检测细菌DNA的分子诊断试验为例，对某患者样本进行系列稀释得到5个稀释度，分别用3个试剂批号进行重复检测，每天重复检测2次，连续检测3天，保证获得至少20个重复检测结果。

（2）数据分析

①取α＝β＝0.05；默认LoB为0，用阴性患者样本进行确认，即某个试剂批号的阴性样本检测结果为0的比例大于100（1-α）%，或者用经典法估计LoB；

③利用专业统计软件（如SPSS等）进行probit回归分析，以分析物浓度为X轴，命中率为Y轴，绘制probit曲线。选择Pearson卡方检验和对数似然比卡方检验检测probit模型的吻合性。图2～4分别为3个试剂批号的probit曲线。

④模型拟合可接受，通过曲线查找通常0.95命中率下的分析物浓度，将该值作为特定批号的LoD。3个试剂批号的LoD分别为0.077 CFU/m l、0.033 CFU/m l和0.031 CFU/m l，将最大值0.077CFU/m l作为测量程序的最终LoD估计值。

表3 各样本命中率结果

图2 probit曲线（批号1）

图3 probit曲线（批号2）

定量限

建立测量程序时应建立LoQ，临床实验室可根据实际情况选择特定的准确度目标，通常以允许总误差（total error allowable，TEa）目标或偏倚和精密度目标的形式进行定义。

图4 probit曲线（批号3）

1.研究设计

仍以免疫法雌二醇测量程序为例，基于经典方法测定LoD。其准确度目标TEa＝21.6%，后者根据C.Ricos教授提供的生物学变异数据库建立的适当的允许总误差质量规范［8］。采用经典的Westgard模型定义总误差（total error，TE）［9-10］利用前文的LoB/LoD数据，选择一个靶浓度作为试验LoQ，LoQ应大于LoD。根据该浓度制备多个低浓度样本进行重复检测，本例为4个样本，用2个试剂批号进行重复检测，每天检测3次，连续检测3天。

2.数据分析

（2）利用Westgard TE模型计算每个试剂每个样本的TE，如表4所示。将每个试剂批号的TE估计值与既定准确度目标进行比较，以满足准确度目标的最低浓度作为该批号的LoQ；

表4 低浓度样本的观察均值、标准差和总误差

（3）本例中所有样本的TE都不满足21.6%。作分析物浓度总误差分布图（线性回归模型），如图5所示，推测准确度目标21.6%对应的浓度约为35pg/m l。制备靶浓度为40pg/m l的5个混合样本，用ID-GC/MS检测得到参考值，并确认其在期望分析物浓度范围内（40±10 pg/m l）。用2个试剂批号进行重复检测，每天检测3次，连续检测3天，重复步骤（1）和（2）；

图5 分析物浓度总误差分布图

表5 各样本总误差及定量限的计算过程

临床实验室应验证检测系统厂家提供的检测下限性能声明，根据检测系统和研究数据的分布特性，选择合适的方法设计LoB、LoD和LoQ的研究方案。研究方案的设计可根据实际情况适当调节，但必须满足最低的重复检测数要求。

1.CLSI.Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation；Approved Guideline.CLSI document EP17-A.Wayne，PA： Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

2.CLSI.Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP17-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

3.王治国主编.临床检验方法确认与性能验证.北京：人民卫生出版社，2009.

4.Ekins RP.The“precision profile”：its use in RIA assessment and design.Ligand Quarterly，1981，4（2）：33-44.

5.CLSI.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP05-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

6.Bliss CI.Themethod of probits.Science，1934，79（2037）：38-39.

7.Burd EM.Validation of labor atory-developed molecular assays for infectious diseases.Clin M icrobiol Rev，2010，23（3）：550-576.

8.Ricos C，Iglesias N，Garcia-Lario JV，et al.W ithin-subject biological variation in disease：collated data and clinical consequences.Ann Clin Biochem.2007，44（4）：343-352.http：//www.westgard.com/biological-variation-in-patients-w ith-disease.htm.Accessed May 14，2012.

9.Westgard JO，Carey RN，Wold S.Criteria for judging precision and accuracy in method development and evaluation.Clin Chem，1974，20（7）：825-833.

10.Petersen PH，Stöckl D，Westgard JO，et al.Models for combining random and systematic errors：assumptions and consequences for different models.Clin Chem Lab Med，2001，39（7）：589-595.

（责任编辑：刘 壮）

△通信作者：王治国，E-mail：zhiguo_w＠hotmail.com