MTT法检测几种多糖和寡糖的体外细胞毒性

刘 凯，朱丽敏，许宝青，刘新轶，谢 楠，王宇希，马恒甲

（浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州 310024）

MTT法检测几种多糖和寡糖的体外细胞毒性

刘 凯，朱丽敏，许宝青，刘新轶，谢 楠，王宇希，马恒甲

（浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州 310024）

选用HL7702正常肝细胞系为靶细胞,用含不同浓度的多糖和寡糖的细胞培养液,通过MTT法进行细胞毒性检测并评价多糖和寡糖的细胞毒性。结果表明,Zymosan A、β-glucan、Lam inarin和酵母细胞壁具有一定的细胞毒性,茶多糖、香菇多糖、黄芪多糖和海藻多糖等对细胞毒性较小,其中海藻多糖对细胞生长具有明显的促进作用。低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水苏糖等4种寡糖在低浓度时均无毒性,在高浓度时低聚异麦芽糖具有一定的细胞毒性,而水苏糖表现出明显的剂量依赖性。

MTT法；细胞毒性；多糖；寡糖

功能性寡糖在饲料工业上称为益生素或益生元,由于其结构稳定,存贮方便,无毒、无害、无残留,作为一种新型的绿色饲料添加剂日益受到重视［1-2］。自20世纪60年代以来,世界各国开始对多糖进行了广泛的研究,认为其具有增强非特异性免疫的功能［1,3］。目前国内外鱼用免疫增强剂的研究比较活跃［1-4］,也普遍认为其对鱼体能起到免疫增强的作用。根据对甲壳动物上的研究结果, Smith等［5］就免疫增强剂能否增强机体免疫功能提出了谨慎的观点,并试验证实葡聚糖等免疫增强剂具有细胞毒性［6］。本试验就此对几种常见的寡糖和多糖等非营养性饲料添加剂,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行了体外细胞毒性试验,以期丰富糖类非营养性饲料添加剂研究的内容。

l 材料与方法

1.1 试验用多糖和寡糖

Zymosan A（纯度＞99%,Wako）是从酵母细胞壁或酵母细胞提取的一种富含葡萄糖甘露糖的多糖。β-glucan（纯度＞99%,Wako）提取自啤酒糖酵母菌。Laminarin（纯度＞99%,Sigma）提取自褐藻掌状海带,为单纯葡萄糖的聚合物。免疫多糖（即酵母细胞壁、酵母多糖）（山东济宁生物科技有限公司）,富含葡聚糖（含量在20%以上）等多糖。低聚异麦芽糖（纯度＞90%）、低聚果糖（纯度＞95%）、低聚木糖（纯度＞95%）、水苏糖（即大豆低聚糖,纯度＞99%）、茶多糖（纯度＞99%）、香菇多糖（纯度＞96%）、黄芪多糖（纯度＞95%）、海藻多糖（纯度＞95%）（国产,杭州捷程生物科技有限公司）。

1.2 受试细胞株

HL7702正常肝细胞系（湖南湘雅医学院）培养于培养皿或培养瓶中；完全培养基为DMEM,含10%胎牛血清,置于5%CO2,37℃培养箱中培养。传代比例1∶3,胰酶消化。

1.3 试剂、仪器与测定

MTT、DMSO（Sigma）；DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清、青链霉素双抗溶液（四季青）；细胞培养皿、细胞培养瓶、96孔板和酶标板（Corning costar）。

酶联免疫检测仪（上海科华试验系统有限公司）,倒置显微镜（日本Olympus有限公司）,CO2恒温培养箱（日本Sanyo公司）,电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）,移液枪（德国Eppendorf公司）,液氮贮存罐（乐山亚西机器厂）,超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）。

1.4 MTT检测细胞活性

样品设10个剂量组（10,20,40,80,160, 320,640,1 280,2 560和5 120μg·m L-1）。取处于对数生长期,生长状态良好的细胞10万个接种至96孔板,每组设3个复孔,另外设阴性对照组（0μg·mL-1）和空白对照组。待细胞贴壁6～8 h后,按照设定浓度添加到细胞中。37℃,5% CO2培养箱中继续培养24 h后检测细胞活性,细胞活性以细胞相对增值百分率（RGR,relative growth rate）表示。

RGR/%=（试验组D值/阴性对照组D值）× 100,根据每组的细胞增值百分率,按表1转换为0～5级毒性分级评价［7-8］。

表1 细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系

1.5 数据处理

采用WPSOffice 2013和SPSS 13.0 for W indows软件进行数据统计,所有数据以平均值±标准误差表示,P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

从表2可见,不同浓度的低聚果糖和低聚木糖对细胞生长表现出先促进而后逐渐抑制的趋势,当其浓度为10μg·m L-1时,显著促进细胞的生长；而当其浓度超过80μg·mL-1后,则其对细胞生长影响与对照组无显著差异。水苏糖对细胞的生长影响随着浓度的递增而增强,当其浓度达到160 μg·m L-1以后,则显著促进细胞生长。低聚果糖、低聚木糖和水苏糖对细胞毒性的评价等级始终在0～1级。低聚异麦芽糖对细胞的生长无明显的促进作用,当其浓度低于80μg·m L-1时,对细胞生长无明显影响；但达到80μg·m L-1后,则明显抑制细胞生长；而浓度达到1 280μg·m L-1后,其毒性评价等级即降到2级。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等3种多糖对细胞生长均未有明显的促进作用。其中Lam inarin浓度达到20μg·m L-1后,则明显抑制细胞的生长；β-glucan浓度达到10μg·mL-1时,即明显抑制细胞的生长；Zymosan A则在浓度为80μg·m L-1以下时,对细胞生长无明显影响,而当浓度达到160μg·m L-1后,明显抑制细胞的生长。由于Zymosan A溶解性差,640μg·m L-1以上浓度不溶,因此结果可能受到影响。以上3种多糖的细胞毒性评价在0～2级。酵母细胞壁对细胞生长的影响与β-glucan类似,浓度达到10μg·m L-1时即明显抑制细胞的生长,其细胞毒性评价等级为1～2级。茶多糖在浓度达到10μg·m L-1时,明显促进细胞的生长；当达到2 560μg·m L-1后,无明显的促进作用,其细胞评级在0～1级。黄芪多糖在浓度低于640μg·m L-1时,对细胞生长无明显作用；浓度达640～2 560μg·m L-1时,对细胞生长具明显的促进作用,此后明显抑制细胞的生长。其细胞毒性评级在0～1级。香菇多糖对细胞生长的影响与黄芪多糖类似,但其浓度在80～640μg·m L-1时,对细胞生长具有明显的促进作用,其细胞毒性评级在0～3级。海藻多糖在浓度为10～5 120μg·m L-1时,对细胞生长均有明显的促进作用,其细胞毒性评级均为0级。

3 小结与讨论

活细胞特别是增殖的细胞中能量代谢旺盛,其中线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的四甲基偶氮唑盐还原成蓝紫色的不溶性的甲瓒,沉积在细胞内和细胞周围,然后用酸化异丙醇溶解。死细胞则无此功能,无甲瓒的形成,凋亡细胞的甲瓒形成能力也降低,表现为吸光度降低。根据对MTT转化能力的高低可判断细胞的存活情况,也可了解组织、细胞的代谢状态。通常组织、细胞代谢活跃时,MTT转化能力较高。目前检测细胞数的常用方法也用［3H］脱氧胸苷摄入法反映细胞的DNA合成。由于DNA合成与细胞的能量代谢密切相关,而MTT法反映细胞的能量代谢,两种方法的结果一致,用MTT法代替［3H］脱氧胸苷摄入法同样可得到满意的结果,且MTT法稳定客观,没有放射性损伤和污染问题［9］。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等均为国外研究较多的不同来源和类型的葡聚糖［1,3］,免疫多糖或称酵母多糖、酵母细胞壁,是目前国内研究较多的一种免疫添加剂［1,3］,其主要成分均为葡聚糖。从本研究结果看,这几种免疫增强剂均具有一定的细胞毒性,这与Hauton等［6］在甲壳动物上的研究结果类似,表明这几种免疫增强剂在使用时一定要注意添加剂量,添加量过高会对机体产生一定的伤害。

茶多糖、香菇多糖、黄芪多糖和海藻多糖等也

是国内近年来研究较多的多糖类添加剂［1,2］。从本试验结果来看,这几种多糖的细胞毒性均较小,且其中海藻多糖对细胞生长具有明显的促进作用。已有报道表明其作为饲料免疫添加剂对动物生长具有明显的促进作用［10-11］。

表2 几种多糖和寡糖体外细胞毒性测定结果

低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水苏糖是4种主要的功能性低聚糖,目前已广泛用于饲料与食品工业［1-2］。这几种寡糖低浓度时对细胞均无毒性,毒性评价等级0～1级,其中水苏糖对细胞生长表现出明显的剂量依赖性,而低聚异麦芽糖在高浓度时表现出一定的细胞毒性,因此在使用中添加量不应过高。

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（责任编辑：张瑞麟）

S 91

A

0528-9017（2014）03-0421-04

文献著录格式：刘凯,朱丽敏,许宝青,等.MTT法检测几种多糖和寡糖的体外细胞毒性［J］.浙江农业科学,2014（3）：421-424.

2013-11-13

杭州市科技局科技计划项目（20120232B07）；浙江省水产农业新品种选育重大科技专项（2012C12907）；杭州市财政专项

刘 凯（1982-）,男,硕士,从事水产养殖方面研究工作。E-mail：liukai0106@hz.cn。