甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA单分散微球的制备及表征

张建平，赵 莹，梁力曼，周世蛟，任艳军，侯文龙，赵永光

(河北科技师范学院化学工程学院，河北秦皇岛，066600)

介质是其液相色谱核心技术之一，介质的研究水平一直制约着液相色谱技术的发展［1］。在以生物大分子为目标产物的分离中，由于生物大分子自身的特殊性，使得对分离介质的要求也比较严格。早期应用最多的材料是多糖基质，但由于只能在较低流速下操作，限制了其应用［2］。对于硅胶介质，能够承受较高的压力，但是只能在较低的pH下稳定操作［3］。之后发展的刚性有机树脂介质有很好的性能，但表面积小、柱容量不高，且装柱难度大，一般来说宜用于分析而不利于制备分离［4］。因此，Afeyan等［5］引入了一个新的色谱概念:灌注色谱。这种色谱介质的基质是高分子材料，它带有两类孔，一类是穿透孔，流体以对流形式通过;另一类是扩散孔，跟一般介质具有的孔一样，流体以扩散的形式通过。穿透孔与扩散孔相连，保证了介质的大比表面积和溶质吸附容量，同时大大降低了利用传统介质进行色谱分离的扩散传质阻力(图1)。而这类介质主要为微米级聚合物微球，作为功能高分子材料，微米级聚合物微球在分析化学，生物化学，免疫医学及某些高新技术领域中有着广泛应用前景。而商品化的流通色谱介质存在着成本高、制备工艺复杂等缺点。因此，新型灌注色谱介质微球的制备一直是研究的热点。

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)微球是一种富含环氧基的功能高分子材料，既具备特定的物理结构，又有良好的化学反应性能［6］，以此类微球为介质的液相色谱适用于生物大分子，尤其是蛋白质的分离纯化。笔者利用分散聚合法制备粒径可控的微米级PGMA单分散种子微球，以期优化合成工艺，对该微球进行结构表征，确定该介质的静态吸附容量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 实验设备 旋转蒸发仪(RE-25C，上海亚荣生化仪器厂生产)，水浴振荡器，光学显微镜(Motic Digital Microscope Motic B5，麦克奥迪实业集团有限公司生产)，扫描电镜(SEM，KYKY-2800，北京中科科仪有限公司生产)，真空干燥箱(ZD79-A，天津中环实验电炉有限公司生产)，紫外可见分光光度计(752N，上海精密科学仪器有限公司生产)。

1.1.2 实验药品 甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，质量分数 ＞0.99)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA，质量分数＞0.98)，牛血清白蛋白(BSA)，上海晶纯生化科技股份有限公司生产;偶氮二异丁腈(AIBN)，天津大沽化工股份有限公司生产;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，天津市风船化学试剂科技有限公司生产;聚乙烯醇(PVA 1788)，十二烷基苯磺酸钠(SDS)，正辛醇，天津光复精细化工研究所生产;甲苯，天津市化学试剂三厂生产。以上均为分析纯。

2 单分散多孔微球的制备

2.1 单分散微球的制备

按比例在100 mL茄形瓶中加入单体(GMA)、引发剂(AIBN)、分散剂(PVP)，无水乙醇和水，超声10 min充分溶解成均相溶液。通入N2排O2。于70℃恒温水浴中旋转加热，一定时间后，产物静置沉降，倾去上层清液。沉降物以无水乙醇洗涤、沉降3次。再用2次水洗涤、沉降3次，得到微球，改变配比重复上述操作以优化反应条件。

2.2 多孔微球的制备

步骤a:将上述制备所得微球储存于PVA的溶液中，分散成100.0 g·L－1匀浆液。取20mL匀浆液分散于100 mL，PVA的质量分数为0.01，SDS的质量分数为0.01的水溶液中，得到种子分散液。

步骤b:在烧瓶中，准确加入一定比例的GMA，EDMA，甲苯，正辛醇，AIBN，超声使完全溶解，加入PVA的质量分数为0.20和SDS的质量分数为0.05水溶液100 mL。反复超声乳化，使油相完全乳化，液面上层无油滴，获得O/W型乳液。

步骤c:将步骤b中的O/W型乳液以2 mL·min－1的速率滴加到含步骤a所得种子分散液的500 mL圆底烧瓶中，在20℃下溶胀12 h后，通N220 min后，N2保护下70℃恒温搅拌反应，聚合24 h，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯/二甲基丙烯酸乙二醇双酯交联微球［7］。

将聚合物微球转入网孔尺寸为0.037 mm的尼龙袋中，在索氏提取器中利用乙醇抽提24 h，以除去聚合物中残存的有机致孔剂和其它可溶性组分，真空干燥后备用。采用文献［8］所述方法，用二乙胺对双孔微球进行表面修饰。

2.3 微球的形貌表征

在室温下，真空干燥计算产率。用光学显微镜(Motic Digital Microscope Motic B5)和Motic Image Advanced 3.0系统观察微球的形貌，测量粒径及粒径分布。以扫描电镜观察双孔微球的表面形貌。

3 结果与分析

3.1 单分散微球制备过程的优化

设计单因素试验，调节4个变量GMA，AIBN，PVP，醇水比中的某一变量，控制其他3个变量不变，合成微球。综合考虑产率、粒径大小及分布因素，讨论影响微球制备的因素。

3.1.1 醇水比对微球合成的影响 控制GMA，AIBN，PVP的量不变，调节醇水比，合成微球。结果表明，随着乙醇中水的比例的增加，合成的PGMA微球产率略微下降，微球粒径是一直增加，但是单分散性也随之变差(图2)。当V(无水乙醇)∶V(水)=46∶4时，得到PGMA微球粒径分散指数达2.267，＞1.05，不再是单分散微球。根据溶液理论，溶解度参数越接近则溶解性越好。在反应体系中，分散剂PVP溶度参数与乙醇相近，所以乙醇含量高时PVP分子更为舒展，从而对聚合物微球具有很好的保护能力。反之，当无水乙醇含量减少时PVP溶解性变差，对微球保护能力下降，聚合物微球发生粘结、聚并，导致分散变宽直至不能成球。由此可知，分散介质中醇与水的比例对微球的形成以及粒径分布非常重要，V(无水乙醇)∶V(水)≥47∶3都可以形成单分散微球。

3.1.2 单体用量对微球合成的影响 控制AIBN，PVP，醇水比的量不变，调节单体GMA的量，合成微球。结果表明，随着单体在体系中的质量分数的增加，PGMA微球产率先升后降，在单体的质量分数为0.10时达到最大(图3)。随着单体在体系中的质量分数的增加，微球粒径是增加的，单体的质量分数达到0.12及以后时粒径增加不明显。而在所实验的单体的质量分数在0.06～0.14范围内，微球粒径均符合单分散性要求。综合考虑上述数据，选择单体的质量分数为0.08～0.10的比例时最合适。

图2 醇水比对微球合成的影响

图3 单体用量对微球合成的影响

3.1.3 引发剂用量对微球合成的影响 控制GMA，PVP，醇水比的量不变，调节引发剂AIBN质量占投入单体质量的比例，合成微球。结果表明，PGMA微球产率随引发剂用量的增加呈先升后降的变化趋势，在引发剂用量为投入单体质量的0.025倍时达到最大(图4)。随引发剂用量的增加，平均粒径呈先降低后增加的变化趋势。随引发剂用量的增加，微球粒径分布呈先变窄而后又略微变宽的变化趋势，引发剂用量为投入单体质量的0.017～0.025倍范围内合成的微球符合单分散要求。综合考虑，引发剂的用量为单体质量的0.021～0.025倍时结果比较好，微球粒径可控，粒径分布较窄。这与一般分散聚合规律类似。

3.1.4 分散剂PVP用量对微球合成的影响 控制其它因素(GMA，AIBN，醇水比)的量不变，调整分散剂PVP占分散介质质量的比例，合成微球。结果表明，随着分散剂用量的增大，PGMA微球产率呈先升高后降低的变化趋势，在分散剂用量为分散介质质量的1.7×10－3倍时达到最高(图5)。随着分散剂用量的增大，微球粒径呈先降低后升高的变化趋势，在分散剂用量为分散介质质量的1.7×10－3倍时最小。随着分散剂用量的增大，合成的微球其分散指数开始变窄而后又呈现增宽趋势，分散剂用量为分散介质质量的1.7×10－3～2.1×10－3倍范围内符合单分散要求。当分散剂用量比较小时，对形成的微球稳定效果差，微球容易发生聚并，得到平均粒径较大的微球，微球的粒度分布变得较宽;当稳定剂用量较大时，对微球的稳定效果比较好，微球之间的聚并少，得到的微球的平均粒径较小，微球的粒度分布也比较窄;但当稳定剂用量过大时，聚合物成核后部分能吸附更多的分散剂形成更大的微球，同时聚合物在微核上的沉积不均匀造成微球粒径大小不均一，粒径变大，但是分布比较宽。上述现象与一般分散聚合规律类似［9，10］。

图4 引发剂用量对微球合成的影响

图5 分散剂用量对微球合成的影响

3.2 静态吸附容量

利用标准间歇式吸附操作测定改性多孔微球对BSA的静态吸附等温线［11］。

其中，q为平衡吸附量(单位:mg·g－1)，qm为饱和吸附量(单位:mg·g－1)，c为水相中蛋白质的平衡质量浓度(单位:g·L－1)，Kd为吸附平衡解离常数(单位:g·L－1)。其饱和吸附容量为93.1 mg·g－1(图6)，说明比表面积值较大。

图6 双孔微球静态吸附等温线

图7 单分散微球的光学显微镜照片

3.3 形貌表征结果

图7为光学显微镜下的种子微球表面形貌，粒径5～6μm，而且分布均匀、单分散系数＜1.05，符合单分散要求。图8为微球在扫描电镜下的微球照片，粒径均匀、表面光滑并无微孔。图9为经一步溶胀法合成的改性多孔微球，从电镜照片中可以看出表面粗糙有许多微孔。

图8 单分散微球扫描电镜照片

图9 改性微球扫描电镜照片

4 结 论

以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在乙醇以及乙醇与水混合体系中用分散聚合法，制备了一系列的粒径可控的单分散的1～8μm的PGMA微球，考量了制备工艺。其中分散体系V(无水乙醇)∶V(水)为 50∶0～47∶3，引发剂 AIBN 用量为单体质量的0.021～0.025倍，分散剂 PVP用量为分散介质质量的 1.7 ×10－3～2.1 ×10－3倍，单体GMA在体系中的质量分数为0.06～0.14时均能得到单分散的微球。经改性得到的多孔微球其对BSA的静态吸附量高达93.1 mg·g－1，在蛋白质分离方面有很好的应用前景。

致谢:感谢河北科技师范学院分析测试中心在样品测试中的帮助和指导!

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