脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析*

徐文斐 刘 萍 李吉涛 李 健 陈 萍

(1.大连海洋大学水产与生命学院 大连 116000;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)又名白虾、小白虾等,隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、长臂虾科(Palaemonidae)、白虾属(Exopalaemon)。脊尾白虾肉质细嫩、繁殖能力强、生长速度快、环境适应性广,分布于我国沿海及大河口的咸淡水处,尤以黄海和渤海产量较多,是我国特有的一种重要经济虾类。

DEAD-box家族蛋白是一类三磷酸腺苷(ATP)依赖的 RNA解旋酶,广泛存在于从细菌到哺乳动物的许多物种中,因其具有高度保守的 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)序列而得名(Linderet al,1989)。该蛋白在细胞RNA代谢中意义重大,参与RNA几乎所有的代谢过程,如:翻译起始、核糖体形成、前mRNA拼接、mRNA降解和细胞器的基因表达等(Rocaket al,2004)。

vasa作为DEAD-box基因家族的重要成员之一,最早在果蝇(Drosophila melanogaster)中被发现,它作为一种母源效应基因在腹节形成和生殖细胞分化中发挥着重要作用(Schüpbachet al,1986)。基于vasa基因在动物中的高度保守性,后来在脊椎动物:斑马鱼(Danio rerio)(Yoonet al,1997;Krvelet al,2004),金鱼(Carassius auratus)(陈云贵等,2005;Otaniet al,2002),罗非鱼(Oreochromis niloticus)(Kobayashiet al,2000),草鱼(grass carp)(Liet al,2010),南方鲇(Silurus meridionalis)(胡重江等,2008),革胡子鲇(Clarias gariepinus)(Raghuveeret al,2012),银鲫(Carassius auratus gibelio)(Xuet al,2005),黄鳝(Monopterus albus)(吕道远等,2005),半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)(张远青等,2012),黑脊倒刺鲃(Spinibarbus caldwelli)(唐良华等,2012)等,以及无脊椎节肢动物拟穴青蟹(Scylla paramamosain)(张凤英等,2012),中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(Wanget al,2013),罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)(Nakkrasaeet al,2007),凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)(Aflaloet al,2007),日本囊对虾(Marsupenaeus japonicas)(Sellarset al,2007),日本沼虾(Macrobrachium nipponense)(朱小玲,2010;Qiuet al,2013),中国明对虾(Fenneropenaeus chinesis)(Zhouet al,2010)等物种中均陆续克隆了vasa的同源基因。在绝大多数物种当中,vasa基因仅限在生殖细胞系中特异性表达,因此被作为一种分子标记物广泛用于研究配子发生和原生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)起源、迁移、分化等方面。进一步研究发现:VASA蛋白对于生殖细胞的形成和卵子极性的建立以及某些发育基因的mRNA转录调控都具有重要作用(Laskoet al,1988;Styhleret al,1998)。

本文以人工养殖的脊尾白虾为对象,应用分子生物学方法,克隆得到vasa基因全长cDNA序列,并对vasa基因在不同组织和卵巢发育不同时期的表达模式进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用脊尾白虾购自潍坊昌邑海丰水产养殖责任公司,成虾200尾。采集血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、肠、胃、眼柄组织立即放入液氮保存。性成熟不同阶段的雌性脊尾白虾,暂养于水生实验室,水温(18±1°C),海水盐度 31,每天换水 2次,投喂配合饲料2次。根据王绪峨(1989)对脊尾白虾卵巢发育外形特征的描述,取卵巢发育不同阶段的脊尾白虾卵巢组织:一部分卵巢固定用于组织学观察,一部分用于vasa基因表达分析。

1.2 组织学实验方法

卵巢用 Bouin’s氏液固定 24h后,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡(熔点 54—56°C)包埋,LEICARM2145切片机连续切片,厚度为6μm。采用苏木精-曙红(H.E)染色,中性树胶封片,Nikon E200型光学显微镜观察及显微摄影(图1)。根据卵巢发育形态特征及其卵细胞类型,将脊尾白虾卵巢发育分为5期,分别为Ⅰ期(形成期)、Ⅱ期(小生长期)、Ⅲ期(大生长期)、Ⅳ期(成熟期)、Ⅴ期(恢复期)(王绪峨,1989;杨筱珍等,2009)。

1.3 总RNA提取

采集发育期卵巢,在研钵中加液氮研磨成粉末状,迅速转移至Trizol试剂中,按照说明书步骤提取总RNA。紫外检测 RNA浓度和纯度,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA完整性。DNaseⅠ(TaKaRa)去除基因组DNA,利用SMART™RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)合成 cDNA 第一链,用做全长cDNA 3′和5′端序列快速扩增的模板。

1.4 Ec-vasa基因片段cDNA克隆

根据 GenBank公布的罗氏沼虾(DQ339110),日本沼虾(HQ385220),拟穴青蟹(GU187045),凡纳滨对虾(DQ095772)vasa基因 cDNA 序列,使用DNAMAN在其保守区设计简并引物V-F、V-R(表1)。以脊尾白虾卵巢cDNA为模板,采用25μl PCR反应体系:TaKaRa Taq(5U/μl),0.25μl;10×PCR Buffer,2.5μl;MgCl2(25mmol/L), 1.5μl;dNTP Mixture(10mmol/ L)(TaKaRa),0.5μl;模板 cDNA,1μl;引物,各2.5μl;ddH2O补足25μl,置于PCR仪中进行扩增。扩增条件:94°C 5min;94°C 30s,58°C 45s,72°C 1min,30个循环;72°C 10min;4°C保温。2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,胶回收目的片段,连接pMD18-T(TaKaRa)载体,重组质粒转化至大肠杆菌 Top10,蓝白斑筛选阳性克隆经菌落 PCR初步鉴定后由上海生工测序。

1.5 5′ RACE 和 3′ RACE

以获得的Ec-vasa基因片段为模板,使用Primer 5.0软件设计用于3′和5′端RACE所需的引物(表1)。使用上述合成的 cDNA第一链为模板,分别用引物Ec-vasa3′和Ec-vasa5′与试剂盒所带通用引物Universal Primer(UPM)配对,并按照 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit推荐的反应体系和反应条件进行Ec-vasa基因3′和5′端基因序列的扩增。PCR扩增产物的纯化、克隆、测序与Ec-vasa基因片段的克隆方法相同。

1.6 序列拼接与生物信息学分析

利用DNAStar软件SeqMan程序对测序结果进行载体序列的去除和拼接。将所得序列提交至 NCBI BLAST程序进行序列比对(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/),利用 DNAStar软件 EditSeq程序进行开放阅读框(ORF)的预测。使用DNAMAN软件进行氨基酸翻译以及脊尾白虾和它物种的 VASA氨基酸序列的多重比对。蛋白质分子质量和等电点(PI)分析使用 PI/Mw(http://us.expasy.org/ tools/pi_tool.html)。利用MEGA 5.0软件(Saitouet al,1987;Tamuraet al,2011)构建Neighbor-Joining(NJ)系统树。

图1 脊尾白虾卵巢发育周期组织切片Fig.1 Histological photomicrographs of the ovary in Exopalaemon carinicauda

1.7 半定量RT-PCR

采集雌性性腺发育脊尾白虾卵巢、血细胞、腮、肝胰腺、肌肉、肠、胃和心脏8种组织,提取各组织中的总RNA,反转录为cDNA,以18sRNA基因作为内参,来检测vasa基因在脊尾白虾不同组织中的表达(引物Ec-vasa-F、Ec-vasa-R、18S-F、18S-R 序列如表1所示)。扩增条件为 94°C 2min;94°C 30s,55°C 45s,72°C 30s,23个循环;72°C 延伸 10min。PCR 扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外凝胶分析。用ImageJ软件计算条带亮度以检测相对表达量。

1.8 实时荧光定量RT-PCR

按照上述1.4部分的方法分别提取脊尾白虾每一阶段(I～V)卵巢的总 RNA,反转录为 cDNA,使用Ec-vasa基因特异引物Ec-vasa-F、Ec-vasa-R和内参基因18sRNA特异引物18S-F、18S-R(表1),采用7500 Sequence Detection System进行实时荧光定量 PCR,扩增体系为 20μl,包括:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)(TaKaRa),10μl;Ec-vasa-F(10μmol/L),0.8μl;Ec-vasa-R(10μmol/L),0.8μl;ROX Reference Dye(50×),0.4μl;cDNA 模板,2.0μl;焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Solarbio),6.0μl。反应条件:95°C 30s;95°C 5s,60°C 34s,40 个循环;95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。实验中每6只的同一阶段卵巢组织混合作为一个样品,数据为3个重复的平均值±标准差,采用 2-ΔΔCT法计算数据,用 SPSS17.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 结果

2.1 Ec-vasa cDNA全长序列

克隆得到Ec-vasa(GenBank登录号:JX122493) cDNA序列全长2516bp,其中5′非编码区 77bp,3′非编码区 636bp,开放阅读框1800bp,编码600个氨基酸,预测其分子量为 65.6kDa,等电点为 5.17。推导的氨基酸序列中包含DEAD-box家族特有的10个保守序列中的8个:AQTGSGKT(MotifⅠ),PTRELA(motif Ia),TIGR(motif Ib),DEAD(motifⅡ),SAT(motif Ⅲ),LVFVE(motif Ⅳ),TAVAARGLD(motifⅤ),HRIGRTGR(motif Ⅵ),此外还有动物VASA蛋白保守序列 GG重复序列,在 N′端具有 7个RG重复序列和1个RGG重复序列,并且发现了一个锌指结构(CCHC)(图2)。

2.2 序列分析和系统进化分析

Blast分析氨基酸序列结果显示Ec-vasa与日本沼虾的同源性最高,为80%,与凡纳滨对虾和中国明对虾同源性同为58%,与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性57%。利用DNAMAN将脊尾白虾 VASA与其他物种VASA氨基酸序列多重对比。结果显示,脊尾白虾 VASA蛋白与其它甲壳类同源蛋白具有多个高度保守区域(图3)。

利用MEGA 5.0软件构建的基于VASA氨基酸序列的 NJ系统树显示,脊尾白虾首先与日本沼虾聚为一支,然后依次为日本囊对虾、凡纳滨对虾、中国明对虾和斑节对虾。位于下方的PL10和P68分支表明本实验克隆获得的基因确为vasa基因(图4)。

2.3 Ec-vasa的组织表达模式

利用半定量 RT-PCR方法研究了Ec-vasamRNA在性成熟脊尾白虾各组织中的表达模式,结果显示:Ec-vasamRNA在脊尾白虾卵巢中特异表达,且表达量丰富,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均没有表达,18sRNA作为阳性对照,在所有组织中均有表达(图5)。

图2 Ec-vasa cDNA全长的核苷酸序列和推导的氨基酸序列Fig.2 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of Ec-vasa

图3 脊尾白虾VASA蛋白氨基酸序列的多重比对Fig.3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences among the VASA proteins from Exopalaemon carinicauda

表1 脊尾白虾vasa克隆和mRNA表达研究所用引物Tab.1 Primers used for E.carinicauda vasa cloning and mRNA expression analysis

图4 脊尾白虾VASA蛋白的系统进化树Fig.4 Phylogenetic analysis of the VASA proteins from Exopalaemon carinicauda

图6中的数据为3个重复的平均值±标准差，从中可以看出卵巢发育Ⅰ期Ec-vasa基因的表达量最高,相对表达量(vasa/18S)的平均值为 3.9014,到了Ⅱ期表达量下降显著(P＜0.01),相对表达量平均值为1.6518。随着卵巢的发育,表达量呈逐渐降低趋势,在Ⅳ期达到最低水平,相对表达量平均值为0.5841。Ⅴ期表达量略回升,与Ⅳ期相比较差异不显著。

图5 RT-PCR分析Ec-vasa在性成熟雌性脊尾白虾各组织的分布Fig.5 Tissue distribution of vasa detected in adult female E.carinicauda by RT-PCR

图6 Ec-vasa在卵巢发育周期中的表达水平Fig.6 Expression of Ec-vasa detected by real-time RT-PCR in the ovary during the development cycle

3 讨论

本实验通过 cDNA克隆成功获得脊尾白虾Ec-vasa全长 cDNA序列,开放阅读框 1800bp;推导出的氨基酸序列与日本沼虾的同源性最高(80%),含有 DEAD蛋白家族 10个保守序列中的 8个:AQTGSGKT序列位于VASA蛋白质N端第198-205位对应ATP-A结构域,是与ATP酶和解旋酶活性密切相关的ATP结合位点;DEAD序列位于312-315位,对应的ATP-B结构域是ATP水解位点,在VASA、PL10和 P68三大亚蛋白家族中均保守存在(Pauseet al,1992);SAT保守区被认为与ATP水解有关;RGLD和HRIGRTGR保守区是具有RNA结合和解旋活性的部位;PTRELA保守区虽然不直接参与ATP结合和水解作用,但却在RNA与RGLD、HRIGRTGR两个结构域的结合中发挥关键性作用(周倩如等,2007);此外 GG重复序列参与 elF4A因子的蛋白间相互作用(Cordinet al,2006;Benzet al,1999)。VASA蛋白特有的锌指结构(CCHC框)可能参与核酸的结合,该结构重复的次数和结构与靶 RNA分子的特异性有关(Sagawaet al,2005)。N末端具有7个RG重复序列和一个RGG序列。上述含有的多个重复序列的甘氨酸富集区(G-rich region)与单链核酸的结合有关,而这正是RNA解旋酶的重要特征(唐良华等,2012)。这些保守序列在脊尾白虾VASA蛋白中均被发现,充分证明此基因为vasa同源基因。vasa在进化上非常保守,这些保守的序列和结构可能对于维持 VASA蛋白的结构和功能至关重要。

Ec-vasa基因在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均没有表达。这一结果与vasamRNA仅在两性生殖细胞中存在较高水平表达,但在其他组织中几乎检测不到其表达信号的情况相符(张远青等,2012;Zhouet al,2010;Wanget al,2013;胡重江等,2008)。上述结果暗示Ec-vasa基因是一种有效的分子标记物,可用于研究脊尾白虾卵巢发育过程。荧光定量 PCR分析显示,随着卵巢的发育,Ec-vasa表达量呈逐渐降低趋势,这与它在中华卵索线虫,中国对虾,中华绒螯蟹等多个物种的性腺成熟过程中的表达量逐渐减弱的变化规律相同(任爽等,2011;Zhouet al,2010;Wanget al,2013)。

结合卵巢组织学分析(图1),在Ec-vasa基因表达量最高的发育Ⅰ期,卵巢主要由卵原细胞组成,细胞处于增殖状态。随着卵巢的发育表达量逐渐降低,Ⅱ期(小生长期)和Ⅲ期(大生长期)的卵巢分别主要由初级卵母细胞、卵黄合成前期卵母细胞和卵黄合成中期卵母细胞组成。在卵巢发育Ⅳ期(成熟期)表达量达到最低水平,此时的卵巢主要由成熟的卵母细胞组成。有研究表明在黑脊倒刺鲃卵子发生过程中,vasamRNA在卵原细胞中阳性信号最强,而在随后各时相的卵母细胞中,vasamRNA的杂交信号明显减弱(唐良华等,2012)。此外,日本沼虾Mn-vasa基因在卵黄发生前期、卵黄发生早期和中期的卵母细胞细胞质中被检测到,而在卵黄积累末期卵母细胞中没有信号(朱小玲,2010)。即在早期的卵母细胞中表达,随着卵母细胞的成熟,表达越来越弱,直至检测不到信号,这些都与本研究实验结果呈现的规律相近似。在海胆(Strongylocentrotus intermedius)(杨晓飞等,2010),银鲫(Xuet al,2005),金鱼(陈云贵等,2005),南方鲇(胡重江等,2008),半滑舌鳎(张远青等,2012)等物种中也均证明了这一规律。造成这一现象的原因可能是卵细胞中大量卵黄的出现,以至vasamRNA的浓度下降(朱小玲,2010);与此同时,vasamRNA的转录速度也可能下降并逐渐中止(唐良华等,2012)。在本研究中,卵巢发育Ⅴ期(恢复期)成熟卵细胞排出,卵巢恢复初始状态,此时卵巢内重新以卵原细胞为主,解释了卵巢发育Ⅴ期表达量出现回升现象的原因。最终,存在于成熟卵子中的vasamRNA,作为母源性遗传物质,通过受精卵被带入新生的个体中。大量研究表明 VASA蛋白对于生殖细胞的形成和卵子极性的建立以及某些发育基因的 mRNA转录调控都具有重要作用(Laskoet al,1988;Styhleret al,1998)。

本研究获得了脊尾白虾的全长vasacDNA,为从分子水平研究脊尾白虾 PGC的起源、迁移和分化提供可靠的分子标记。结果表明,vasa基因可能在脊尾白虾卵巢发育的调控过程中起着关键作用;作为一种母源性基因,vasa基因还可能与子代原始生殖细胞的形成、迁移、分化等发育过程密切相关,其中相关的调控机制还有待于进一步的研究。

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