中性粒细胞凋亡的研究进展

郝 建(综述)，何先弟(审校)

(蚌埠医学院第一附属医院ICU，安徽 蚌埠 233000)

中性粒细胞是血细胞中寿命最短的终末分化细胞，也是运动活泼、吞噬积极、胞质内富含毒性颗粒的炎性细胞，在机体的非特异性免疫防御中起重要作用。临床上最常见的炎症性疾病，究其发生与发展的细胞、分子机制都与中性粒细胞密切相关[1]。中性粒细胞凋亡后被完整地吞噬而不释放细胞内容物，从而可以减少中性粒细胞介导的机体炎症损害，中性粒细胞的凋亡过程影响着炎症的发展和转归。中性粒细胞凋亡有其特定的分子及代谢基础，受机体多种因子的调节，与多种信号途径有关，是炎症消散的关键，也是机体自我限制炎性反应的一种重要方式。

1 中性粒细胞凋亡的特征

中性粒细胞来源于骨髓的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或组织。中性粒细胞是血细胞中寿命最短的终末分化细胞，也是机体最主要的炎性细胞。中性粒细胞凋亡分为两种方式，一种是自发性凋亡，同其他的血细胞和组织细胞在凋亡的发生机制上有所不同，中性粒细胞从分化成熟开始，就启动自发性凋亡程序；另一种是同其他细胞一样，可能被某些因素(如Fas/FasL、肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体、细胞因子受体、饥饿等)激发诱导而加速其凋亡的进程[2-3]。中性粒细胞凋亡是一个受多基因调控和众多细胞因子及其他多种因素调节的复杂过程，在炎症的发生、发展和转归中起着至关重要的作用[4-6]。

2 中性粒细胞凋亡的分子机制

中性粒细胞凋亡在炎性疾病演变过程中起重要作用，但中性粒细胞凋亡的分子机制目前尚不完全清楚。最近研究表明，许多基因参与中性粒细胞凋亡的调节，凋亡中性粒细胞的内在生化改变和细胞表面分子标志物改变，是吞噬细胞识别，清除的基础[7-9]。中性粒细胞凋亡的表达调控着细胞的命运，细胞凋亡时有基因的不正常表达。Fas、FasL和p53在多数凋亡的中性粒细胞均有表达，与此相反，c-myc的表达减少[10]。在中性粒细胞悬液中应用抗人Fas单抗可以促进凋亡，而应用抗FasL抗体却有相反的作用。中性粒细胞之间的Fas和FasL的相互作用诱导的Fas的活化是中性粒细胞自发凋亡的机制之一。

中性粒细胞凋亡与白细胞介素(interleukin，IL)1β转化酶家族密切相关。IL-1β转化酶家族既能促进新合成的pro-IL-1β转化为有活性的IL-1β，又能裂解细胞内维持结构和功能的基质蛋白，通过激活家族内其他成员介导细胞凋亡。研究发现，中性粒细胞凋亡与Ⅰ型环腺苷酸依赖性蛋白激酶的激活有关，且通过含半胱氨酸的胱天蛋白酶3(caspase-3)上游激活，而使环腺苷酸依赖性蛋白激酶发挥作用，研究还发现虽然并不是所有的caspase都在中性粒细胞上表达，但是caspase-3活性可在凋亡的中性粒细胞上被检测到，并与形态和生化变化同步，证实了caspases的重要性[11-13]。也有研究发现，应用脂多糖、粒细胞集落刺激生物因子可使caspases和IL-1β在中性粒细胞上表达增加，从而使中性粒细胞凋亡表达趋缓，这种凋亡延迟作用可因阻断蛋白质的合成和应用酪氨酸激酶而减弱[14]。

3 中性粒细胞凋亡的信号途径

调控中性粒细胞凋亡的途径主要包括胞外刺激、胞内信号转导及核内基因转录的活化，其中以胞内信号转导为中性粒细胞凋亡的主要途径[15-16]。中性粒细胞凋亡的信号途径是在多种外界因素的作用下，受自身多种基因调控、众多细胞因子参与、多条途径独立或交联而形成的复杂的调控网络。目前的研究报道，关于中性粒细胞凋亡的信号途径主要包括Fas/FasL通路、p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号转导通路、p53依赖性通路、核因子κB存活蛋白通路、磷脂酰肌醇3-羟激酶(phosphoinositide-3-kinase PI3K)-Akt通路、胞外信号调节激酶信号转导通路等。

3.1Fas/FasL信号途径 Fas(CD95/APO-1)是肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族。Fas蛋白N端在膜外，其配体结合前聚集域，在结合配体前即促使Fas自身三聚体化；C端在膜内，有一段与细胞凋亡信号的传递密切相关的“死亡结构域”，它由长80个氨基酸的序列组成[17]。FasL为Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族成员，有278个氨基酸长，由胞质区、跨膜区和胞膜外区组成。Fas/FasL信号转导途径以Fas相关死亡结构域蛋白为其连接分子，Fas与FasL结合可迅速激活相关蛋白酶的水解活性。中性粒细胞通过表达Fas和FasL，调控细胞凋亡，保持自身数量的稳定。

3.2p38MAPK 信号转导途径 MAPK是细胞内重要的信号传递者，参与了多种生理过程的调节。MAPK信号通路是多级激酶的级联反应，包括三个关键的激酶：MAPK、促分裂原活化的蛋白激酶激酶和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶。真核细胞中已确定出4条MAPK 信号转导通路，即胞外信号调节激酶通路、c-Jun氨基端激酶通路、p38通路及胞外信号调节激酶5通路[18]。其中p38信号途径是MAPK家族中的重要组成部分，细胞外的多种应激如放射线、紫外线、热激蛋白、促炎因子、特定抗原等，可使p38MAPK活化。p38MAPK在凋亡、细胞因子产生、转录调节等方面起着重要作用，激活p38MAPK可能促进中性粒细胞凋亡。

3.3p53依赖性通路 p53基因是一种抗癌基因，基因组DNA长约20 kb，当DNA受到损伤时急剧增加，使细胞周期进一步运转受到抑制。p53被认为是最重要的介导细胞凋亡基因[20]。大量研究表明，p53参与细胞生长、分化及死亡的调控，与细胞凋亡有密切关系。p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其他信号转导通路间的联系十分复杂，其中p53参与调控的基因已超过160种。目前公认p53蛋白参与的细胞凋亡通路有2条，即死亡受体通路和线粒体凋亡通路[19]。p53通过Bax/Bcl-2、Fas/Apol、胰岛素样生长因子-BP3等蛋白调控细胞凋亡，通过肿瘤坏死因子受体等死亡信号受体途径诱导凋亡。Bcl-2可阻止从线粒体释放出来的凋亡形成因子(如细胞色素C等)而发挥抗凋亡功能；Bax可与位于线粒体上的电压依赖性离子通道作用，介导细胞色素C的释放；p53可通过Bax的表达水平上调，Bcl-2的表达下调，共同促进细胞凋亡。

3.4核因子κB存活蛋白途径 核因子κB蛋白家族是一种具有多效性的转录因子，包括5个亚单位：Rel(cRel)、p65(RelA,核因子κB3)、RelB和p50(核因子κB1)、p52(核因子κB2)。细胞因子、细菌脂多糖等相关刺激均与核因子κB的活化有关，核因子κB调控参与早期的免疫反应和炎性反应各阶段的许多分子，包括肿瘤坏死因子α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、诱导型一氧化氮合酶、环加氧酶2、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等。研究发现，多种核因子κB抑制剂能促进体外培养人血中性粒细胞的自发性凋亡，且呈现出时间依赖性和剂量依赖性，而对肿瘤坏死因子α诱导中性粒细胞凋亡具有协同效应[20]。核因子κB是调节控制中性粒细胞凋亡的重要的转录因子，炎性介质所导致的中性粒细胞凋亡的延迟与核因子κB的激活有关。

3.5PI3K-Akt 信号转导途径 PI3K是由相对分子质量110×103的催化亚基与85×103的调节亚基组成的二聚体蛋白，PI3K是一个复杂的大家族，根据其结构可分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型PI3K又分为IA和IB两个亚型，他们分别从G蛋白连接受体和酪氨酸激酶连接受体传递信号。PI3K信号参与繁殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种代谢调节。Akt能直接使多种转录因子磷酸化，作为PI3K信号转导通路下游的一个效应分子，通过对这些转录因子的调控，可以阻止凋亡基因的表达和加强抗凋亡基因的表达，从而使细胞存活。

4 中性粒细胞凋亡的检测方法

中性粒细胞作为急性炎症的重要指标之一，其凋亡与体外循环、全身炎性反应密切相关。中性粒细胞凋亡介导炎性反应终止。中性粒细胞数量的检测常规采用外周血白细胞计数，亦可进行骨髓涂片、采用趋化试验和吞噬功能检查，但这些都不能反映中性粒细胞吞噬杀灭病原体的复杂过程。采用流式细胞仪测定中性粒细胞的凋亡率，利用全血细胞计数仪测定中性粒细胞数量，利用酶联免疫吸附测定血浆弹性蛋白酶水平，利用透射电镜观察中性粒细胞凋亡细胞形态学变化，从各个环节找出中性粒细胞功能失调的原因，为临床诊断由中性粒细胞减少和功能失调所造成的疾病提供帮助[21]。

5 中性粒细胞凋亡的生物学意义

中性粒细胞是炎性反应的重要标志，在炎性反应的发生、发展和转归中起着至关重要的作用。正常生理情况下，中性粒细胞的增殖与凋亡保持动态平衡，既有利于机体的防御反应，又有利于炎性反应的消散。适度地调控中性粒细胞凋亡信号或改变某些细胞信号的转导途径，对于治疗创伤、控制炎症具有重要的意义[22]。采用有效方法调节炎性反应，可以提高机体存活率，改善预后，增强治疗效果。中性粒细胞凋亡是终止中性粒细胞介导炎性反应的重要生物途径，研究中性粒细胞凋亡机制有利于了解机体炎症作用机制；研究中性粒细胞凋亡对机体的影响为药物研发、临床研究感染/炎性损伤等疾病的治疗提供深入的理论指导。

6 小 结

中性粒细胞的转归直接影响着炎症的进展情况，它有两种转归：凋亡和坏死。凋亡是对机体损伤最小的清除方式，也是促进其炎症消除的重要机制。凋亡的中性粒细胞内虽然含有害物质，但在功能上却处于和外界隔离的状态。如果凋亡延迟的中性粒细胞不能被巨噬细胞及时吞噬清除，接下来的中性粒细胞继发性坏死可能会进一步加大炎性反应。适时适度地干预中性粒细胞凋亡的中间环节有可能成为治疗脓毒症新的措施。在炎症早期从较高水平上对中性粒细胞的凋亡过程进行调节，可能对炎症的控制达到较好的效果。核因子κB是中性粒细胞凋亡中的具有调控促炎因子基因表达作用的重要转录因子，是极具潜力的新型抗炎靶点。适度地应用特异性的核因子κB抑制剂可能为脓毒症的治疗提供抗生素外的新型治疗方法。

[1] Blagitz MG,Souza FN,Santos BP,etal.Function of milk polymorphonuclear neutrophil leukocytes in bovine mammary glands infected with Corynebacterium bovis[J].J Dairy Sci,2013,96(6):3750-3757.

[2] Dengler V,Downey GP,Tuder RM,etal.Neutrophil Intercellular Communication in Acute Lung Injury:Emerging Roles of Microparticles and Gap Junctions[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013.[Epub ahead of print].

[3] Osorio JS,Trevisi E,Ballou MA,etal.Effect of the level of maternal energy intake prepartum on immunometabolic markers,polymorphonuclear leukocyte function,and neutrophil gene network expression in neonatal Holstein heifer calves[J].J Dairy Sci,2013,96(6):3573-3587.

[4] Kalimo H,del Zoppo GJ,Paetau A,etal.Polymorphonuclear neutrophil infiltration into ischemic infarctions:myth or truth?[J].Acta Neuropathol,2013,125(3):313-316.

[5] Bian Z,Guo Y,Luo Y,etal.CD47deficiency does not impede polymorphonuclear neutrophil transmigration but attenuates granulopoiesis at the postacute stage of colitis[J].J Immunol,2013,190(1):411-417.

[6] 王晓龙,周向东.核转录因子-κB抑制因子对中性粒细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2010,30(2):194-196.

[7] Kang JH,Kim SS,Yang MP.Effect of parenteral l-alanyl-l-glutamine administration on phagocytic responses of polymorphonuclear neutrophilic leukocytes in dogs undergoing high-dose methylprednisolone sodium succinate treatment[J].Am J Vet Res,2012,73(9):1410-1417.

[8] Shi H,Yu HJ,Wang HY,etal.Topical administration of peroxiredoxin-6 on the cornea suppresses inflammation and neovascularization induced by ultraviolet radiation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(13):8016-8028.

[9] Yano J,Kolls JK,Happel KI,etal.The acute neutrophil response mediated by S100 alarmins during vaginal Candida infections is independent of the Th17-pathway[J].PLoS One,2012,7(9):e46311.

[10] Hsieh SC,Huang MH,Tsai CY,etal.The expression of genes modulating programmed cell death in normal human polymorphonuclear neutrophils[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,233(3):700-706.

[11] Ma HJ,Huang XL,Liu Y,etal.Sulfur dioxide attenuates LPS-induced acute lung injury via enhancing polymorphonuclear neutrophil apoptosis[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(8):983-990.

[12] Hoelker M,Salilew-Wondim D,Drillich M,etal.Transcriptional response of the bovine endometrium and embryo to endometrial polymorphonuclear neutrophil infiltration as an indicator of subclinical inflammation of the uterine environment[J].Reprod Fertil Dev,2012,24(6):778-793.

[13] Reino DC,Palange D,Feketeova E,etal.Activation of toll-like receptor 4 is necessary for trauma hemorrhagic shock-induced gut injury and polymorphonuclear neutrophil priming[J].Shock,2012,38(1):107-114.

[14] Baines KJ,Simpson JL,Bowden NA,etal.Differential gene expression and cytokine production from neutrophils in asthma phenotypes[J].Eur Respir J,2010,35(3):522-531.

[15] Wood LG,Garg ML,Gibson PG.A high-fat challenge increases airway inflammation and impairs bronchodilator recovery in asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2011,127(5):1133-1140.

[16] Scott HA,Gibson PG,Garg ML,etal.Airway inflammation is augmented by obesity and fatty acids in asthma[J].Eur Respir J,2011,38(3):594-602.

[17] Baines KJ,Simpson JL,Wood LG,etal.Systemic upregulation of neutrophil α-defensins and serine proteases in neutrophilic asthma[J].Thorax,2011,66(11):942-947.

[18] 张国明,王禹,李天德,等.应激活化蛋白激酶在大鼠缺血后适应中的变化及其对细胞凋亡影响的研究[J].浙江大学学报:医学版,2009,38(6):611-619.

[19] Morton JP,Kantidakis T,White RJ.RNA polymerase III transcription is repressed in response to the tumour suppressor ARF[J].Nucleic acids research,2007,35(9):3046-3052.

[20] Chen A,Seifert HS.Neisseria gonorrhoeae-mediated inhibition of apoptotic signalling in polymorphonuclear leukocytes[J].Infection Immunity,2011,79(11):4447-4458.

[21] 吴国荣,陈国千,王春新,等.重症监护病房患者中性粒细胞VCS参数检测的临床意义[J].中华医院感染学杂志,2011,19:4054-4056.

[22] 姜丽娜,李柏青,姚春艳,等.Th1型和Th2型细胞因子对人中性粒细胞吞噬结核杆菌活性的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2010,30(6):576-580.