人羊膜上皮细胞减轻肺损伤的研究进展

甘文婷 (综述)，孙 新，陆 琰(审校)

(广州市妇女儿童医疗中心，广州 510623)

肺损伤是由物理性、化学性、药物性、机械性和生物性等多种刺激因素引起的肺上皮细胞和内皮细胞功能形态异常，从而释放大量的炎性介质导致肺表面活性物质降低，肺泡损伤、水肿，肺组织纤维化等病理改变，最终引起以呼吸困难为主要表现的临床常见疾病[1-2]。机械通气、糖皮质激素、肺表面活性物质替代等经典治疗方法，可在一定程度上改善肺损伤患者的临床表现和预后，但缺乏特效的治疗方法。随着再生医学的不断发展及肺损伤患者对预后及生活质量要求的不断提高，医学工作者也在积极寻找新的治疗方法改善患者预后，在一定程度上推动了细胞治疗在肺损伤方面的研究发展。目前国内外多项研究已陆续证实骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可减轻脂多糖、博来霉素、大肠埃希菌内毒素、支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)等引起的急慢性肺损伤[3-5]。并在活体中证明了BM-MSCs是通过旁分泌机制发挥其有利作用的[6-7]。人脐带血间充质干细胞亦同样具有减轻高氧导致的新生小鼠肺损伤引起的BPD[8-10]。继间充质干细胞之后，近几年关注度不断升高的人羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells，hAECs)在减轻肺损伤的作用及其机制等方面的研究,也取得了一定进展。

1 hAECs的特点及其运用价值

hAECs是人羊膜细胞的组成部分[11]。人羊膜细胞来源于孕妇分娩后废弃胎盘上的羊膜组织，是由受精卵发育至第8日的囊胚内细胞团分化而来的，由hAECs和人羊膜间充质干细胞两种细胞构成，保有最早的胚胎干细胞特性，具备向三个胚层组织分化的能力[12-13]。hAECs与BM-MSCs、人脐带间充质干细胞大多数表面抗原相似，CD29、CD73、CD105、CD90、CD44及多能性干细胞表面标志Oct4、Nanog均阳性表达，而CD14、CD34、CD45等造血干细胞标志及人类白细胞DR抗原均阴性表达[14-15]。其中hAECs还表达胚胎干细胞全能性表面标志SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81，这些均是保持胚胎未分化性能及维持全能分化潜能的重要标志性因子[11]。然而,hAECs虽具有干细胞特性，但从本质上来说并不属于干细胞，因为它不能无限生长，只是一类具有干细胞特性的上皮细胞，且其生物学特性与孕妇所处的孕期相关[16]。

近期有研究提出已在体外建立了无限增殖的hAECs，以期将其更好地用于疾病的治疗[17]。典型的hAECs一般为圆形或椭圆形，可呈铺路石样生长，且表达上皮细胞标志角蛋白19，不表达波形蛋白。hAECs、BM-MSCs及人脐带间充质干细胞具有相似的干细胞特性，相比人脐带间充质干细胞，hAECs尚无显著优势，但对于BM-MSCs需通过有创途径获得，且随着年龄的增长，细胞数量显著下降，分化能力降低，hAECs有来源丰富等众多优越性，因此其在肺损伤的运用价值将更加广阔。

2 hAECs减轻肺损伤的作用及其机制

随着hAECs的各种干细胞特性及众多优越性逐渐得到证实，其在治疗肺损伤方面的研究日益增多，目前研究较多的为其在各种肺损伤中的作用及其机制。

2.1hAECs减轻肺损伤的作用及可能影响因素 2009年Cargnoni等[18]研究同种异体羊膜细胞及异种羊膜细胞(人羊膜细胞)在博来霉素所致C57BL/6小鼠肺损伤中的作用，提出无论是同种异体还是异种羊膜细胞均能减缓博来霉素引起的肺部炎症及纤维化，两者无显著差异，从而提出人羊膜细胞具有干细胞特性及减轻肺损伤的作用。2010年Moodley等[19]通过研究经静脉移植hAECs对博来霉素所致免疫功能缺陷小鼠肺损伤的干预作用，发现hAECs通过减少肺内炎性因子,如白细胞介素1、肿瘤坏死因子β等释放、胶原沉积，表达Ⅱ型肺泡细胞表型等作用减轻肺部炎症及纤维化,并促进肺损伤的修复，与其他干细胞来源的实验研究相比，本实验的移植成活率较高，从而提出干细胞移植存活率可能受导致肺损伤的原因、给药方式、干细胞类型及实验研究所用的免疫功能缺陷小鼠的影响。

2011年Murphy等[20]进一步研究证实,hAECs对博来霉素所致免疫功能正常小鼠的肺损伤也具有同样的保护作用，更加突出了hAECs低免疫原性的优势，本实验观察到hAECs主要通过抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、转化生长因子β等炎性因子减轻肺部炎症及纤维化而其调节功能很可能受到机体对损害反应的影响，且进一步研究单独使用人羊膜间充质干细胞在肺损伤中的作用十分必要。同时实验中发现未受到博来霉素作用的免疫功能正常小鼠使用hAECs会引起一定程度的肺部炎症，而该作用对正常肺部是否存在潜在的不良影响尚需深入研究，因为这与hAECs是否能运用于无肺损伤个体的预防性治疗密切相关[18，20]。同年Vosdoganes等[21]发现hAECs通过宫内移植，具有与在博来霉素所致小鼠肺损伤中相似的免疫调节作用，能减轻脂多糖引起的胎羊肺损伤，但不能阻止其引起的肺发育的改变。

2012年Murphy等[22]在之前研究结论的基础上报道，对比hAECs在博来霉素所致表面蛋白C正常(Sftpc+/+)和表面蛋白C缺失(Sftpc-/-)的小鼠肺损伤中的作用，发现hAECs在(Sftpc+/+)小鼠中具有和之前研究中一致的减轻肺损伤的作用，而(Sftpc-/-)小鼠的肺损伤无任何改善，(Sftpc-/-)小鼠巨噬细胞的吞噬功能受损，这似乎提示hAECs对肺损伤的修复作用与宿主巨噬细胞功能是否正常有关。同年Hodges等[23]报道，宫内hAECs移植可减轻宫内胎羊机械通气所致的肺损伤。近期Vosdoganes等[24]进一步报道,hAECs可改善高氧导致的新生小鼠肺损伤引起的类似BPD的肺组织改变和对生长发育的影响，并且正常对照组予以hAECs不会引起肺组织损害，与hAECs在脂多糖、博来霉素等引起的肺损伤中的作用相比，hAECs在该研究中改善肺损伤的作用较小，这可能与hAECs移植方式、移植的时间及损伤因素作用于肺组织的时间有关。

2.2人羊膜上皮细胞减轻肺损伤的机制 hAECs可减轻脂多糖、博来霉素、高氧等因素引起的肺损伤已得到证实，但其具体的作用机制尚不清楚。Cargnoni等[18]提出hAECs移植后在骨髓、脑、肺组织等脏器中均有定植，但其减轻肺损伤的作用机制可能是通过生长因子和细胞因子的旁分泌作用。细胞本身是否可分化修复肺组织尚不清楚，近些年相关机制的研究陆续增多。Moodley等[19]发现,hAECs移植到肺损伤的小鼠中可表达肺组织相关标志甲状腺素转录因子，而该因子为肺早期发育的标志是气管形成和Ⅱ型肺泡细胞形成的关键性因素。Murphy等[20]提出,在目前的研究中仍然没有合理证据证明在肺损伤的活体组织中保留有意义数量的活性hAECs，减轻肺损伤作用的大小似乎与hAECs是否在肺中定植及其多少无显著正相关。

在随后Tan等[25]研究小组成员的进一步研究中发现,hAECs不仅通过减少小鼠肺部巨噬细胞的迁移使得巨噬细胞释放减少达到减轻肺损伤的作用，而且可促进肺泡中巨噬细胞表型由主要的炎症型M1转化为修复型M2，这点在Ionescu等[6]对比骨髓间充质干细胞条件培养液与BM-MSCs对肺损伤的作用机制研究中也有提及。并提出这些影响至少部分与hAECs释放的可溶性因子有关，而与细胞间的相互作用无关联，从而进一步证实hAECs对肺损伤的修复作用主要通过免疫调节，而不是hAECs在肺中的定植。同年Vosdoganes等[21]通过宫内移植hAECs实验进一步证实了甲状腺素转录因子的存在，通过观察到的与Murphy等[20]研究相似的低移植率提出，hAECs对肺损伤的各种调节作用很可能是通过免疫调节而不是移植成活率。并首次用数据证实hAECs在胎羊中具有促进表面活性蛋白生成的能力，而这些活性蛋白对维持肺组织结构、减轻肺部炎症均有一定作用。Murphy等[22]进一步研究hAECs在肺损伤中的作用机制，发现了其他研究中提及的表面活性蛋白，根据实验结果提出表面活性蛋白在减轻肺损伤过程中发挥重要作用。然而,该研究未观察到其他实验中提及的hAECs可在肺中定植及分化为肺上皮细胞[18]。

Hodges等[23]证实hAECs减轻肺损伤过程中表面活性蛋白SP-C的存在，提出hAECs在活体内可分化为肺泡细胞，这点结论与其他研究有所不同，然而该实验存在很多局限性，胎内机械通气所致的肺损伤在临床新生胎儿中不存在、样本量小，该作用在大样本动物实验中是否存在需进一步研究。hAECs具有与BM-MSCs同样的减轻肺损伤的作用，目前许多研究均认为hAECs对肺损伤的修复作用是通过免疫调节实现的，但具体的作用机制尚不清楚，BM-MSCs与hAECs在治疗肺损伤作用机制中有何异同尚需继续考究。

3 人羊膜上皮细胞临床应用前景

目前hAECs的临床前研究已涉及各个医学领域，在不同原因所致急、慢性肺损伤方面的研究也日益增多，其中最受期待的莫过于在BPD中的运用。随着医学技术的不断发展，胎龄<30周的低出生体质量乃至极低出生体质量早产儿的存活率逐渐增高，早产出生及生后长时间和高浓度吸氧容易引起肺部炎症及纤维化，而这些均是引起BPD高危因素，使得早产儿BPD的发生率逐渐升高，是重要的致死和致残性疾病[2]。传统的治疗方法以激素治疗为主，有研究报道激素治疗BPD可导致肺泡壁厚度增加，对肺组织有不同程度的不利影响[26]。

目前，BM-MSCs、hAECs可减轻高氧所致的新生小鼠肺损伤在临床前研究中已得到证实，基于hAECs众多优越性，若能将其运用于新生儿高氧肺损伤的临床治疗中，那将大大降低新生儿BPD的发生率，对减轻社会负担及提高早产儿的生活质量均有重大意义。hAECs具有向三个胚层分化的能力，除了在肺损伤方面的作用，hAECs在治疗糖尿病、神经系统、内耳等多个组织器官病变的临床前研究也取得了一定进展，若能成功运用于临床，hAECs在各个医学领域的作用将不可估量。近期有研究提出，间充质干细胞在肺中的少量定植对肺损伤的长期修复可能发挥重要作用，且移植的时间与修复作用的程度也密切相关[9，27]。因此,对于一些研究中观察到的定植于肺组织中的无意义数量的hAECs,在肺损伤中是否发挥作用及高氧肺损伤中hAECs的最佳移植时间、移植方式、移植剂量及运用于治疗时三者最佳的搭配方式等的研究意义重大。目前对于分离、消化、提取、纯化hAECs尚无统一的方法，hAECs中不可避免混杂有少量的人羊膜间充质干细胞，对于不同研究组观察到的hAECs移植后是否定植于肺组织中截然相反的结论，该现象的出现是否与可能混杂的人羊膜间充质干细胞有关，在hAECs减轻肺损伤的作用中会不会存在人羊膜间充质干细胞协同或单独发挥作用尚不清楚。随着科技的进步，相信关于hAECs运用于肺损伤治疗的众多疑惑将逐一解决，在不久的将来hAECs移植可成为临床可行的减轻肺部炎症及预防BPD的有效治疗方法。

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