调节性B细胞在风湿性疾病中的研究进展

张笑梅(综述)，王晓非(审校)

(中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科,沈阳 110022)

风湿性疾病是泛指影响骨、关节及周围软组织的一组疾病，免疫损伤在其发病机制中占有重要位置。一般认为，B细胞可通过产生特异性抗体或多种细胞因子等发挥上调免疫反应的作用,也可作为专职抗原呈递细胞参与免疫反应[1]。近年来，人们发现了与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)相对应的一组具有负向免疫调节功能的B细胞亚群，在多项以自身免疫病小鼠为动物模型的实验研究中[3-8]，发现调节性B细胞(Regulatory B cell，Breg)可通过分泌抑制性介质或作用于其他免疫细胞等机制发挥免疫抑制作用[2]。Breg细胞同样存在于人类，与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus eythematosus，SLE)、原发性干燥综合征(primary Sjogren′s syndrome，pSS)、抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)、相关性血管炎、活动性结节病等风湿性疾病的发生、发展密切相关。现就Breg在风湿性疾病中的研究进展予以综述。

1 调节性B细胞的发现

最早在20世纪70年代，人们已发现了B细胞可能存在免疫抑制作用[3]，直至近些年B细胞的这种作用再次被高度关注。1996年Wolf等[4]首先阐述了B细胞在自身免疫性疾病中起到免疫调节作用，在这项研究中，B细胞缺陷小鼠体内诱导的试验性自身免疫性脑脊髓膜炎小鼠较野生型小鼠更易恶化，且缺少野生实验性自身免疫性脑脊髓膜炎小鼠的自愈倾向。由此推测，小鼠体内可能存在具有免疫调节功能的B细胞，并指出这种B细胞可能通过分泌调节性介质等机制发挥作用。上述结果在次年的一项研究中得到证实，Mizoguchi等[7]在炎症性肠病小鼠模型中得到此种B细胞存在的有力证据，并将其命名为Breg。随着多次针对Breg在动物模型中的探索，发现Breg与多种自身免疫性疾病的发生、发展存在密切关联。Breg同样存在于人类，与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、ANCA相关性血管炎、活动性结节病等风湿性疾病密切相关。

2 Breg的功能及作用机制

目前认为Breg细胞一方面可分泌白细胞介素10(interleukin,IL-10)及转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等相关因子[8]，抑制Th0向Th1及Th2转换，减少肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ干扰素(interferon-γ,INF-γ)等炎性因子产生，下调自身免疫反应及过度免疫[9-10]；另一方面B细胞可通过影响Treg数量及功能而发挥免疫调节作用[11]，方式多样。Blair等[12]首先描述了人产生IL-10的Breg在体外的免疫抑制作用，发现将CD4+T细胞与CD19+CD24+CD38+B细胞共同培养降低了CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+TNF-α+T细胞的比率，他们认为这种作用需要T-B细胞直接接触及IL-10、CD80、CD86的参与，而不需要TGF-β参与，这点与鼠类不同。Iwata等[9]研究发现，鼠类CD24+CD27+Breg对Th1分化增殖起到抑制作用，进而展开对人Breg免疫调节机制的研究，发现人CD24+CD27+Breg没有影响Th1细胞分化增殖，仅能减少TNF-α产生。人Breg也不能影响Th17分化[12-13]。由此，与鼠类不同，人Breg对Th细胞作用并不明显，机制更倾向于分泌抑制性介质。Ray等[11]研究表明，B细胞缺陷小鼠或CD20单抗去除B细胞小鼠外周血Treg数量较野生小鼠明显减少，将野生小鼠B细胞过继转移至B细胞缺陷小鼠中发现Treg数量恢复，说明B细胞中存在可影响Treg数量的亚群。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid—inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR)参与Treg增殖[14]，而Breg表面可表达GITR配体[15]，因此考虑B细胞对Treg的作用可能通过其自身表达的GITR配体起作用，Ray等[11]的研究也支持了这种观点。

3 与Breg相关的风湿性疾病

3.1系统性红斑狼疮 最初在小鼠模型中，Yan等[16]将小核RNA分别注入含有抗小核RNA B细胞的MRL/pr小鼠(一种狼疮小鼠，模拟人SLE)及对照小鼠体内，发现前者出现自身免疫反应，后者则出现T细胞耐受,Lemonine等[17]认为上述结果可能是因为MRL/pr小鼠免疫调节有缺陷，而对照小鼠体内存在某种可调节自身反应的B细胞，随后的研究证明这种细胞为MABreg及T2Breg。

Blair等[18]将竞争性抗CD40抗体活化后的T2 Breg转移至MRL/pr小鼠体内，发现T2 Breg可显著改善狼疮性肾炎小鼠的存活率，由此,以过渡2型边缘区前体(transitional two marginal zone precursor,T2MZP) Breg为作用靶点的抗CD40单抗有望应用于狼疮性肾炎治疗。

随后，人们逐渐将研究对象由动物模型转移至SLE患者。Blair等[12]的研究中，证实了CD19+CD24hiCD38hiB细胞具有免疫调节能力。他们将健康人及SLE患者外周血单个核细胞分别分为两组，A组：去除CD19+CD24hiCD38hiB细胞，B组：不去除CD19+CD24hiCD38hiB细胞，以CD40mAb刺激72 h，健康人A组中CD4+IFN-γ+及CD4+TNF-α+T细胞显著增多，而SLE患者则无显著变化；此研究还得出SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞数量与健康对照者相比无显著变化，但较健康对照组分泌IL-10减少，这提示SLE患者CD19+CD24hiCD38hiB细胞虽数量上并没有减少，但缺乏相应的负向免疫调节作用，因此Breg功能受损可能是SLE发生、发展的机制之一。

3.2类风湿性关节炎 Breg为B细胞大家庭中的一员，在CD20单抗去除B细胞的胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠中，炎性关节炎较对照组CIA小鼠明显加重[19]。并发现，如果在胶原诱导前去除B细胞可减少疾病的发生和抗体产生，从临床症状到关节滑膜的组织学病变都相对减轻；如果先由Ⅱ型胶原诱导关节炎，则去除B细胞对关节炎进展及疾病严重程度没有明显的影响。以上结果说明，B细胞对CIA小鼠关节炎起始阶段有更为重要的免疫调节作用，若关节炎症已经发生则调节作用相对减弱。

考虑到Breg存在对CIA小鼠的保护作用，若将Breg在体外激活然后过继转移到CIA小鼠体内是否同样有益呢？Mauri等[20]发现，体外使用胶原及CD40单抗刺激B细胞可使其部分产生IL-10，将这种激活的Breg通过腹膜内注射的方法注入CIA小鼠体内，发现可以显著降低小鼠关节炎发病率及疾病的严重程度，抑制Th1的分化，这种保护作用与IL-10作用密不可分。Yang等[21]的研究支持上述观点，他们将体外激活的B10细胞过继到类风湿关节炎小鼠体内发现其存在与上述研究相似的保护作用，并发现可能与产生IL-17的CD4+T细胞数量减少相关，这项研究也提示B细胞可以通过作用于T细胞来发挥免疫调节作用。对于风湿免疫科的医师来说，这种转移B细胞的方法为未来类风湿关节炎的治疗提供了一个新的视角。

对类风湿关节炎起保护作用的Breg存在多种不同表型，不同表型的Breg来源也不同，有研究认为CD5+CD1d+B细胞可抑制接触性皮炎的超敏反应，与边缘带B细胞、T2MZP B细胞、B1亚群B细胞有交集[8,22]，随后有人将边缘带细胞、滤泡B细胞、T2MZP三种B细胞过继于DBA/1小鼠中，发现只有T2MZP B细胞可降低类风湿关节炎发病率及疾病严重程度[23]，由此，对类风湿关节炎具有保护作用的Breg可能来源于T2MAP B细胞。

在动物模型中得到了肯定结果后，针对类风湿关节炎患者的研究也在逐渐展开。Ma等[24]发现，新发类风湿关节炎患者外周血Breg(CD19+TIM1+IL-10+B细胞及CD19+CD5+CD1d+IL-10+B细胞)数量较健康对照组减少。以类风湿关节炎疾病活动性评分(DAS28)来评判患者疾病活动度，发现类风湿关节炎患者外周血Breg数量与疾病活动度呈负相关，其中Breg数量的变化与Treg数量呈正相关。

3.3原发性干燥综合征 目前对于Breg细胞与pSS关系的研究仅有少量文献报道。有研究表明，pSS患者外周血CD19+Breg较正常对照组及SLE对照组增多，且与血清IgG呈正相关；初治组Breg百分比较免疫抑制组升高，由此推测Breg比例升高提示可能病情较为严重，并认为Breg参与了pSS发病。Blair等[12]对pSS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞功能进行研究，提示经CD40刺激后对CD4+IFN-γ+及CD4+TNF-α+T细胞的抑制功能较健康对照者无明显差异。Furuzawa-Carballeda等[25]对pSS患者外周血调节性细胞也进行了研究，也得到了pSS患者组外周血IgA+B10细胞较对照组升高的结果，即使是临床缓解期的患者，外周血多种表型的产生IL-10的Breg仍较对照组比例升高。综上所述，对于pSS患者而言，Breg功能可能是正常的，而Breg比例上的升高可能是疾病发生、发展的机制之一。

3.4ANCA相关性血管炎 ANCA相关性血管炎患者外周血中Breg比例与健康对照组相比也存在差异，一项研究发现CD19+IL-10阳性B细胞在静止期与活动期的ANCA相关性血管炎患者中较健康对照组显著减少[26]。健康状态下的Breg可调控Th1分化[13]，研究发现静止期ANCA相关血管炎患者Breg比例与Th1细胞呈负相关，可见Breg在疾病静止期对Th1细胞的分化也起到某种调控作用，然而在活动期Breg调控作用不足，这与活动期SLE患者中的研究结果相同。综上，Breg数量减少或功能受损导致的调控作用不足可能是疾病活动的原因之一。另外，ANCA相关性血管炎患者Breg可能通过Treg起到免疫调节作用。ANCA相关性血管炎患者中Breg比例与CD39+Treg关联，而CD39+Treg可以有效抑制Th17应答[27]，因此这可能也是Breg在此疾病中发挥调节作用的机制之一。目前，Breg在ANCA相关性血管炎中作用的机制、与疾病严重程度是否相关，对血管的病变有何影响等问题仍有待研究。

4 展 望

Breg在人B细胞中比例仅占0.2%～0.6%，但其免疫调节作用却十分明显。以目前的研究来看，Breg在风湿病患者与其他自身免疫性疾病患者中可能存在几种问题：①Breg数量减少；②Breg功能障碍。虽然有很多机制及功能仍待研究，但可以肯定Breg的作用有益于风湿性疾病及其他自身免疫性疾病的转归。在对未来风湿病的治疗中，可以考虑以下几种可能的以Breg为主角的治疗方案：①体内增殖Breg或自体Breg体外增殖后重新转移到体内；②将B细胞消除治疗设法改进为保留Breg的选择性B细胞消除治疗；③设法改善Breg的免疫调节功能障碍。目前仍有许多问题有待解决，如Breg是否与Treg同样代表一种独立的调节性细胞谱系及Breg调节机制也尚需更加细致的研究。相信通过对Breg作用及发挥作用机制的研究终会为未来风湿病的治疗提供更多的可能性。

[1] LeBien TW,Tedder TF.B lymphocytes:how they develop and function[J].Blood,2008,112(5):1570-1580.

[2] Khan WN,Wright JA,Kleiman E,etal.B-lymphocyte tolerance and effector function in immunity and autoimmunity[J].Immunol Res,2013,57(1/3):335-353.

[3] Katz SI,Parker D,Turk JL.B-cell suppression of delayed hypersensitivity reactions[J].Nature,1974,251(5475):550-551.

[4] Wolf SD,Dittel BN,Hardardottir F,etal.Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell-deficient mice[J].J Exp Med,1996,184(6):2271-2278.

[5] Nguyen TG,Little CB,Yenson VM,etal.Anti-IgD antibody attenuates collagen-induced arthritis by selectively depleting mature B-cells and promoting immune tolerance[J].J Autoimmun,2010,35(1):86-97.

[6] Xiu Y,Wong CP,Bouaziz JD,etal.B lymphocyte depletion by CD20monoclonal antibody prevents diabetes in nonobese diabetic mice despite isotype-specific differences in FcγR effector functions[J].J Immunol,2008,180(5):2863-2875.

[7] Mizoguchi A,Mizoguchi E,Smith RN,etal.Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor α mutant mice[J].J Exp Med,1997,186(10):1749-1756.

[8] Fillatreau S,Sweenie CH,McGeachy MJ,etal.B cells regulate autoimmunity by provision of IL-10[J].Nat Immunol,2002,3(10):944-950.

[9] Iwata Y,Matsushita T,Horikawa M,etal.Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells[J].Blood,2011,117(2):530-541.

[10] Yanaba K,Bouaziz JD,Matsushita T,etal.The development and function of regulatory B cells expressing IL-10(B10 cells) requires antigen receptor diversity and TLR signals[J].J Immunol,2009,182(12):7459-7472.

[11] Ray A,Basu S,Williams CB,etal.A novel IL-10-independent regulatory role for B cells in suppressing autoimmunity by maintenance of regulatory T cells via GITR ligand[J].J Immunol,2012,188(7):3188-3198.

[12] Blair PA,Norea LY,Flores-Borja F,etal.CD19+CD24hiCD38hiB cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic lupus erythematosus patients[J].Immunity,2010,32(1):129-140.

[13] Matsushita T,Horikawa M,Iwata Y,etal.Regulatory B cells(B10 cells) and regulatory T cells have independent roles in controlling experimental autoimmune encephalomyelitis initiation and late-phase immunopathogenesis[J].J Immunol,2010,185(4):2240-2252.

[14] van Olffen RW,Koning N,van Gisbergen KP,etal.GITR triggering induces expansion of both effector and regulatory CD4+T cells in vivo[J].J Immunol,2009,182(12):7490-7500.

[15] Nocentini G,Riccardi C.GITR:a modulator of immune response and inflammation[J].Adv Exp Med Biol,2009,647:156-173.

[16] Yan J,Mamula MJ.B and T cell tolerance and autoimmunity in autoantibody transgenic mice[J].Int Immunol,2002,14(8):963-971.

[17] Lemoine S,Morva A,Youinou P,etal.Regulatory B Cells in Autoimmune Diseases[J].Ann N Y Acad Sci,2009,1173(1):260-267.

[18] Blair PA,Chavez-Rueda KA,Evans JG,etal.Selective targeting of B cells with agonistic anti-CD40is an efficacious strategy for the generation of induced regulatory T2-like B cells and for the suppression of lupus in MRL/lpr mice[J].J Immunol,2009,182(6):3492-3502.

[19] Yanaba K,Hamaguchi Y,Venturi GM,etal.B cell depletion delays collagen-induced arthritis in mice:arthritis induction requires synergy between humoral and cell-mediated immunity[J].J Immunol,2007,179(2):1369-1380.

[20] Mauri C,Gray D,Mushtaq N,etal.Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells[J].J Exp Med,2003,197(4):489-501.

[21] Yang M,Deng J,Liu Y,etal.IL-10-Producing Regulatory B10 Cells Ameliorate Collagen-Induced Arthritis via Suppressing Th17 Cell Generation[J].Am J Pathol,2012,180(6):2375-2385.

[22] Ding Q,Yeung M,Camirand G,etal.Regulatory B cells are identified by expression of TIM-1 and can be induced through TIM-1 ligation to promote tolerance in mice[J].J Clin Invest,2011,121(9):3645-3656.

[23] Gray M,Miles K,Salter D,etal.Apoptotic cells protect mice from autoimmune inflammation by the induction of regulatory B cells[J].Proc Natl Acad Sci,2007,104(35):14080-14085.

[24] Ma L,Liu B,Jiang Z,etal.Reduced numbers of regulatory B cells are negatively correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis[J].Clin Rheumatol,2013,33(2):187-195.

[25] Furuzawa-Carballeda J,Hernandez-Molina G,Lima G,etal.Peripheral regulatory cells immunophenotyping in Primary Sjogren′s Syndrome:a cross-sectional study[J].Arthritis Res Ther,2013,15(3):R68.

[26] Wilde B,Thewissen M,Damoiseaux J,etal.Regulatory B cells in ANCA-associated vasculitis[J].Ann Rheum Dis,2013,72(8):1416-1419.

[27] Fletcher JM,Lonergan R,Costelloe L,etal.CD39+Foxp3+regulatory T Cells suppress pathogenic Th17 cells and are impaired in multiple sclerosis[J].J Immunol,2009,183(11):7602-7610.