10株鸡源奇异变形杆菌的质粒消除及耐药性研究

苏葳艺，李欣南，韩镌竹

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016）

10株鸡源奇异变形杆菌的质粒消除及耐药性研究

苏葳艺，李欣南，韩镌竹

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016）

为建立SDS消除奇异变形杆菌质粒的方法，了解奇异变形杆菌的质粒与奇异变形杆菌耐药性表型之间的关系，采用正交设计的试验方法研究奇异变形杆菌的消除条件，并采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行验证，筛选出质粒消除效果最佳的试验条件。采用微量稀释法进行质粒消除前后奇异变形杆菌对13种抗生素的药敏性测定。结果显示，消除效果最好的条件为消除剂SDS浓度0.2%，温度42℃，消除72 h。将该组消除后不含质粒的奇异变形杆菌与原含质粒奇异变形杆进行耐药性试验，结果表明，10株鸡源奇异变形杆菌消除质粒后，其中9株对头孢噻呋的药物敏感性由耐药变为敏感。

奇异变形杆菌；质粒消除；耐药性

奇异变形杆菌（Proteus mirabi l is）属于变形杆菌属（proteus），广泛存在于泥土、水和粪便污染的物质中，可引起食物中毒、泌尿系感染等，近年来由奇异变形杆菌引起的食物中毒事件较多[1-6]。鸡奇异变形杆菌病（Proteus mirabi l is disease）是近年来国内新发现的一种急性热性细菌性传染病[7-8]。该病的特征是食欲下降、翅膀下垂、咳嗽、体温升高、腹泻。病鸡主要表现为菌血症、败血症，各代，从而造成雏鸡的大批死亡。临床数据表明该病的发病率和死亡率均较高[9]。随着广谱抗生素特别是头孢菌素的大量应用，临床耐药菌株的产生日益严重，其耐药性也在不断增加，给临床抗感染治疗带来极大的困难[10]。

种日龄的鸡群都可感染本病，但以7周龄以下的雏鸡最易感，种鸡感染本病后可通过种蛋传给后

细菌的耐药性可由染色体遗传基因介导或质粒携带的基因介导产生。随着细菌耐药性形成机制研究的深入，独立于细菌染色体以外的遗传物质——质粒所编码的耐药性越来越受到重视[11]。本试验通过正交试验的方法来研究奇异变形杆菌的质粒消除条件，筛选出质粒消除的最佳试验条件，并考察质粒消除对试验奇异变形杆菌耐药表型的影响。

本试验通过正交设计的方法来研究奇异变形杆菌的质粒消除条件，筛选出质粒消除的最佳试验条件，将质粒消除前后的菌株进行耐药性试验，通过比较两组耐药性结果来证明质粒对奇异变形杆菌耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器生物安全柜（美国NUAIRE）；全自动高压灭菌器（日本三洋）；电热恒温培养箱（MEMMERT）；DENSIMAT麦氏比浊仪（梅里埃）；ABT Expression鉴定仪（梅里埃）；HITACHI CF16RX离心机（日立）；BIO-RAD紫外凝胶成像系统（美国伯乐）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2 试剂与材料TIAN GEN快速质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）；ID32E鉴定条（梅里埃）；冻干型动物源细菌药敏检测板（天津金章）；甘油（国药）；SDS（国药）；TBE Buf fer.（北京普利来技术有限公司）；Loading Buf fer（大连宝生物）；Marker DL1000、Marker DL2000（大连宝生物）；Agarose Regular琼脂糖（大连宝生物）；营养琼脂培养基（北京陆桥技术有限公司）；LB肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司）；营养肉汤培养基（青岛高科园海博生物有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的活化 取菌种保藏管中的试验菌株100μL于10 mL营养肉汤中37℃培养24 h，划线接种于营养琼脂平板，37℃倒置培养24 h，备用。

1.3.2 奇异变形杆菌的鉴定 采用棉签取1.3.1新鲜培养的单菌落于生理盐水中，浊度调至0.5麦氏，然后吸取菌液到ID32E鉴定条按照鉴定条说明进行操作，37℃培养24 h，然后放入ABT Expression鉴定仪（梅里埃）中做生化鉴定。

1.3.3 药物敏感性测定（微量稀释法） 采用含有13种抗生素的肠道杆菌96孔冻干药敏板进行药敏试验。用棉签取培养好的单菌落于3 mL生理盐水培养瓶中，放到麦氏比浊仪中调菌浓至0.5麦氏，吸取100μL菌液于10 mL MH肉汤培养液的平皿中，摇匀，反复吸打几次，然后吸取100μL菌液依次加入到96孔耐药板中，右下角一个空加入100μL肉汤培养液作为空白对照，最后盖好盖子放入培养箱中37℃培养24 h。24 h后取出药敏板，打开盖子，放在镜子上观察，透明的为阴性反应（-）即菌体未生长，有浑浊菌液的为阳性反应（+）。

1.3.4 奇异变形杆菌的质粒提取 用TIAN GEN快速质粒小提试剂盒提取10株奇异变形杆菌的质粒，按照试剂盒说明书进行提取，然后将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，进行后续试验。

1.3.5 奇异变形杆菌SDS质粒的消除的正交试验以消除时间、消除温度和消除剂浓度作为考察因素，设计出9种不同的条件进行考察。通过文献查阅和预试验确定SDS浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%，因素水平表见表1～2。

表1 奇异变形杆菌质粒消除影响因素水平表Table1 For singular proteus plasm id elim inate the factors affecting the inspection tab le

表2 奇异变形杆菌消除正交试验设计表Table2 singular proteus elim inates orthogonal experimental design

将含质粒奇异变形杆菌的新鲜培养物接种于10 mL LB肉汤的试管中，37℃振荡培养24 h。依表1配置不同浓度的SDS LB肉汤，分装，120℃高压灭菌15 min。依表2分别加入新鲜LB肉汤培养物10μL，在不同条件下进行质粒消除试验。消除后进行平板培养获得质粒消除菌株。依照1.2.4进行质粒提取，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。电泳条件为：浓度电泳1%、电泳电压127 V、电泳时间37 min。

1.3.6 消除质粒前后药敏结果比较 采用微量稀释法分别测定消除质粒前后同一株奇异变形杆菌的药敏敏感性，并将结果进行比较和分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定对1010株菌株进行生化鉴定采用梅里埃半自动细菌鉴定仪对菌株进行鉴定，以生化鉴定作为最终判定标准。结果10株菌的生化谱显示均为奇异变形杆菌。表3为奇异变形杆菌生化鉴定谱。

2.2 奇异变形杆菌的质粒提取用TIAN GEN快速质粒小提试剂盒提取10株奇异变形杆菌的质粒，并做琼脂糖凝胶电泳试验检验质粒是否提取到，结果10株奇异变形杆菌均含有质粒，重复质粒提取试验，结果一致，见图1。

图1 奇异杆菌质粒消除前，提取质粒的电泳图谱Fig.1 Be fore singular coli plasm id elim ination,the extraction o f plasm id e lectrophoresis

2.3 含质粒奇异变形杆菌质粒的消除通过正交试验筛选奇异变形杆菌最佳质粒消除条件为：消除剂SDS浓度为0.2%，消除温度42℃，消除时间72 h，电泳图见图2。

2.4 质粒消除前后奇异变形杆菌的药物结果比较质粒消除前后药敏结果比较如图3所示，头孢噻呋的耐药性在质粒消除前后变化较大，由消除前的100%耐药变为消除后仅有10%耐药。阿莫西林的耐药性由50%增加到70%，而庆大霉素的耐药性由70%增加到80%。

表3 奇异变形杆菌生化鉴定谱Table3 Proteus m irabilis biochem ical spectrum

图2 消除时间72 h，消除温度42℃，消除剂SDS浓度为0.2%的质粒提取电泳图谱Fig.2 To elim inate tim e 72 hours,e lim inate 42℃ tem perature,elim inate the SDS concentration of 0.2%of p lasm id extraction and electrophoresis

图3 奇异变形杆菌质粒消除前后对13种抗生素的耐药率柱状图Fig.3 The singular proteus plasm id elim ination of 13 kinds of antibiotic resistant rate before and after the histogram

3 讨论

通过控制变量的方法对质粒消除的条件进行研究，发现在消除剂SDS浓度为0.2%、消除温度42℃、消除时间72 h时，消除效果最佳。龙海英等[12]报道大肠埃希菌的SDS消除浓度为0.05%，说明不同菌种的消除条件有着较大差异。

根据奇异变形杆菌质粒消除前后药敏结果的比较发现，头孢噻呋的耐药性在质粒消除前后变化较大，由消除前的10株全部耐药变为消除后仅有1株耐药9株敏感，说明奇异变形杆菌所含头孢噻呋耐药基因部分由质粒介导，这一结果与Yuj i Watanabe[13]报道变形杆菌所含头孢呋新耐药基因部分由质粒介导的试验结果一致，说明奇异变形杆菌的二代、三代头孢类耐药基因可能均系质粒介导。本试验结果未发现质粒消除前后氨苄西林和四环素耐药性发生明显变化，可以推断氨苄西林和四环素的主要耐药机制可能不在质粒上。试验发现质粒消除后阿莫西林的耐药性和庆大霉素的耐药性发生微量的变化，但整体耐药性消除前后变化不大。说明奇异变形杆菌对试验的其他12种抗生素的主要耐药机制比较复杂。

由于兽医临床用药的不规范和饲养环节长期低剂量使用抗生素，造成细菌耐药越来越严重，耐药机制越来越复杂，严重影响了养殖业的健康发展。因此，临床主要抗生素的耐药机制研究，对于控制细菌耐药性的蔓延具有重要意义。

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（编辑：张婷婷）

Drug-resistance research and elim ination of drug resistance p lasm ids of 10 strains of chicken source Proteusm irabilis

Su Weiyi,Li Xinnan,Han Juanzhu
(Liaoning province of veterinary feed quality and safety of animal products testing center,Liaoning Shenyang 110016)

To establ ish a SDS method for el iminating Proteus mirabi l is plasmid,understanding the relationship between plasmid and Proteus Baci l lus drug resistance phenotype.To study the el imination conditions of the Proteus mirabi lis using experimental orthogonal method,veri fied the methods with agarose gel elect rophoresis,screened the best experiment conditions to el iminated the plasmid.Proteus drug sensitivity to 13 antibiotics was determined by microdilution method, then plasmid were el iminated.The resul ts showed the best ef fective el iminate tconditions was agent concent ration of SDS 0.2%,temperature 42℃,lasted for 72 hours.Then drug-resistance tests were took place to detect the susceptibil ity of Proteus with and without plasma.The resul ts showed that,10 drug-resistance st rains of chicken source Proteus when el iminated plasmid,9 st rains were sensitive to cef tiofur.

Proteus mirabi l is;Plasmid el imination;Drug resistance

S852.61

：B

：1672-9692(2014)10-0005-05

2014-09-22

苏葳艺（1987-）男，本科，研究方向为畜产品质量安全。