原花青素A-1体内外对猪与小鼠T淋巴细胞亚群的影响

刘英姿，董筱萍，程　迪，周铁忠

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁　锦州　121001）

原花青素A-1体内外对猪与小鼠T淋巴细胞亚群的影响

刘英姿，董筱萍，程迪，周铁忠⋆

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001）

为研究从碎米花杜鹃叶中分离得到的化合物原花青素A-1（Proanthocyanidin A-1，简称PAA-1）的免疫增强活性，初步从细胞水平上探讨其免疫增强机制。体外试验采用流式细胞术，检测PAA-1体外对小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群CD 4和CD 8单阳性和双阳性T淋巴细胞亚群百分率及CD4+/CD 8+比值；体内试验通过饲喂不同剂量的PAA-1后，检测试验猪外周血淋巴细胞CD4和CD 8单阳性以及CD 4+/CD 8+比值。结果证明，体外试验中同阴性对照组相比，PAA-1能单独或协同Con A提升具CD 4+、CD 8+及CD 4+CD 8+表型的T淋巴细胞亚群百分率，提高CD4+/CD 8+的比值；体内试验中饲喂中、高剂量的PAA-1的试验猪外周血中具有CD 4+、CD 8+表型的T淋巴细胞的百分率及CD 4+/CD8+的比值均有显著提高。说明PAA-1可通过增加辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞数量、促进T淋巴细胞的成熟以及增加CD 4+/CD 8+的比值发挥增强细胞免疫的作用，为其进一步开发为新型免疫增强剂提供试验依据。

原花青素A-1；T淋巴细胞亚群；小鼠；仔猪

原花青素是一种在植物界中广泛存在的多酚类化合物。国内外的一些研究证实，其具有抗氧化、保护心血管、抗癌、抗炎、免疫调节、保护肝肾功能等多种药理活性。国内外对原花青素类化合物的研究主要集中在其强的抗氧化活性方面，对于其免疫调节活性却极少报道。

课题组对从碎米花杜鹃提取物乙酸乙酯部分分离得到的化合物原花青素A-1（以下简称PAA-1）的免疫调节活性进行了测定，证实PAA-1体外能极显著地刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖，具有免疫增强作用[1]。

为了研究PAA-1刺激淋巴细胞增殖作用的机理，本试验运用流式细胞术检测了PAA-1作用后的小鼠脾脏CD4和CD8单阳性和双阳性T淋巴细胞亚群百分率和CD4+/CD8+比值以及体内对试验猪外周血淋巴细胞CD4和CD8单阳性以及CD4+/CD8+比值的影响，从分子水平上分析其免疫增强的作用机理。

1　材料与方法

1.1试验动物的选择和分组处理体外试验：健康Balb/c小鼠，6～8周龄，SPF级，体重20±2 g，雄性，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(吉2003-0001)。

体内试验：于凌海大业乡生态猪场选取30～35日龄的健康断奶三元杂交仔猪（“杜长大”）40头，随机分为4组，每组10头，其中3个试验组，1个对照组。3个试验组分别在日粮中不添加（对照组）、添加2 mg/kg（试验1组）、4 mg/kg（试验2组）和8 mg/kg（试验3组）的PAA-1，连用10 d。4组仔猪经驱虫后分圈饲养于同一全封闭猪舍，由同一饲养员管理，自由采食和饮水。

1.2PAA-PAA-11的提取方法干燥的碎米花杜鹃Rhododendron spici ferum叶10 kg经粉碎后，用70%丙酮水泡样3次，减压回收，水相依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压蒸馏（40℃）回收乙酸乙酯萃取部分（600 g）。乙酸乙酯部分用90%甲醇水经MCI脱除色素，得浸膏500 g。取500 g浸膏，80∶100目硅胶2 000 g上样，以氯仿∶丙酮（1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4）梯度洗脱，在氯仿：丙酮7：3段反复运用各种色谱技术（硅胶柱色谱，凝胶柱色谱，ods反相硅胶）分离出化合物PAA-1,纯度98%以上，其化学结构见图1。

图1 PAA-1的结构Fig.1　The chem ical structure of proanthocyanidinA-1

1.3主要试验试剂与仪器胰蛋白酶：Gibco产品，CD4/L3T4-PE、CD8/Lyt-2-FITC荧光标记抗体：Southern Biotech产品；FITC-标记抗猪CD4单抗、PE标记抗猪CD8单抗购自BD公司；溶血素购自Beckman Coul ter公司。2.5%小牛血清-PBS：将2.5 mL小牛血清溶于97.5 mL PBS，混匀用于细胞的洗涤，现用现配；1%甲醛-PBS：将1 mL甲醛溶于99 mL PBS，混匀用于重悬细胞；调机器用样品包括每种染料的单阳性细胞和无染料的阴性细胞，上述试剂由辽宁医学院科学实验中心配制。流式细胞仪：美国BD公司LSRII数字化分析型流式细胞仪。

1.4小鼠脾淋巴细胞的准备及分组试验共分为4组，分别为阴性对照组、单药组、Con A对照组和组合PAA-1组。制备小鼠脾淋巴细胞悬液，加入24孔细胞培养板，每孔1 mL，阴性对照组，每孔再分别加入1 mL RPMI-1640完全培养液；单药组，再加入含有100 mg/L PAA-1的RPMI-1640完全培养液1 mL，使PAA-1终浓度分别为50mg/L；Con A对照组，每孔再加入1ml含10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培养液；组合PAA-1组加入含100 mg/L PAA-1和10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培养液1 mL，使PAA-1和Con A的终浓度分别为50 mg/L和5 mg/L，每组均设2个复孔，每孔溶液终体积为2 mL。

1.5小鼠脾淋巴细胞培养与处理上述细胞放入细胞培养板标记好后，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h；收集悬浮及贴壁细胞于离心管中，用低温冷冻离心机4℃ 1 500×g离心5 min，倾弃上清，残余上清用滤纸吸净；加入2 mL PBS，用移液枪轻轻吹匀，于4℃ 1 500×g离心5 min，倾弃上清，残余上清用滤纸吸净，重复操作2次；加入1 mL 70%冰乙醇（-20℃预冷）对样品进行固定，轻轻吹匀，保存于-20℃待用。

1.6流式细胞术测小鼠T淋巴细胞亚群取一组按1.5中方法处理好的小鼠脾淋巴细胞，于4℃1 500×g离心5 min，倾弃上清，残余上清用滤纸吸净；用PBS洗2次，弃上清，再加PBS重悬细胞；分别加入荧光标记抗体，CD4/L3T4-PE（剂量为0.2μg/106个细胞），CD8/Lyt-2-FITC（剂量为1μg/106个细胞），4℃避光反应30 min；PBS洗1次，以便去除未标记上的荧光抗体；然后加500μL PBS重悬细胞，200目尼龙膜过滤，上流式细胞仪，设定575 nm和530 nm氩激光强度对小鼠脾脏T淋巴细胞膜表面标志CD4及CD8表达量的变化进行测定，用Becton–Dickinson数据分析软件分析细胞亚群结果，每个样品以10 000个细胞计数，结果以CD4+CD8―%、CD4―CD8+%、CD4+CD8+%表示PAA-1对小鼠脾中T淋巴细胞各亚群百分率的影响。

1.7流式细胞术检测试验猪外周血T淋巴细胞亚群饲喂PAA-1 10 d后，前腔静脉抽取试验猪的全血2 mL，肝素抗凝。取配好的肝素抗凝血100μL，加入相应荧光染料染色4℃，15 min，避光；BECKMAN溶血素裂解红细胞（200μL/管）30℃，30 min；2.5%小牛血清-PBS洗涤1～2次，800～1 000 r/min，离心10 min；1%甲醛-PBS重悬，上机检测[2]。

1.8统计学处理所得数据用平均值士标准差（x-±SD）表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析和Duncan’S多重比较。用P＜0.05或P＜0.01对试验组与对照组样本均数间具显著性差异进行标识，所有试验结果均重复操作3次。

2　结果与分析

表1　PAA-1体外对T淋巴细胞亚群的影响Table1　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lymphocytes in vitro

2.1PAA-PAA-11体外对小鼠脾淋巴细胞亚群的影响见表1。

如表1所示，与阴性对照组相比，经浓度为50 mg/L PAA-1刺激后，小鼠脾中具CD4+与CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率极显著增加（P＜0.01）；CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率在该浓度显著增加（P＜0.05）；CD4+/CD8+比值也有所提高。PAA-1协同Con A（PAA-1 50 mg/L+Con A 5 mg/L）作用后与对照组相比，CD4+表型的显著升高(P＜0.05)；CD4+/CD8+比值虽较Con A对照组低，但仍比对照组高。

PAA-1单独作用对CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率均略高于PAA-1与Con A协同作用，这表明PAA-1单独作用对T淋巴细胞表达CD4+/CD8+的影响好于与有丝分裂原共同作用，说明PAA-1本身就具有很好的免疫调节活性。

2.2饲喂PAA-PAA-11对试验猪外周血T淋巴细胞亚群的影响见表2。

表2　PAA-1体内对猪外周血T淋巴细胞亚群的影响Tab le2　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lym phocytes in vivo

表2可见，在饲料中添加不同剂量的PAA-1 10 d后，对试验猪进行淋巴细胞亚类检测，结果表明，具有CD4＋、CD8＋表型的T淋巴细胞亚群百分率在所有的试验组均高于对照组。其中试验1组CD4＋亚群显著高于对照组（P＜0.05）；而试验2、3组极显著高于对照组（P＜0.01），试验2,3组之间差异不显著。试验1、2组CD8＋亚群多于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；试验3组显著高于对照组（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值的变化：试验2、3组显著高于对照组（P＜0.05），试验1组与对照组差异不显著（P＞0.05）。

3　讨论

3.1CD4和CD8是T淋巴细胞膜上最关键的分化抗原。CD4主要表达于辅助性T细胞，具有调节免疫反应活性、辅助B细胞产生抗体、分泌细胞因子；CD8主要分布在细胞毒性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞表面，有免疫抑制和细胞毒性的作用[3]。 CD4+/CD8+的比值是一重要的评估机体免疫状态的依据[4]。体内外试验均证实，PAA-1能提高CD4+/ CD8+的比值，具有免疫增强作用。

3.2流式细胞术检测结果显示，体外实验中同阴性对照组相比，PAA-1单独作用能极显著提升具CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率（P＜0.01）；PAA-1协同Con A作用，也能使CD4+与CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率显著升高（P＜0.05），而且对CD4+/CD8+的比值均有提升作用；体内试验中饲喂中、高剂量PAA-1的试验猪外周血中具有CD4+、CD8+表型的T淋巴细胞的百分率均显著或极显著提高了（P＜0.05），CD4+/ CD8+的比值也有显著提高（P＜0.05）。说明PAA-1通过增加具辅助性功能的T淋巴细胞数量以及细胞毒性T淋巴细胞数量，促进T淋巴细胞的成熟以及增加CD4+/CD8+的比值来发挥免疫调节作用。

[1]刘英姿，罗有梁，周铁忠.碎米花杜鹃原花青素A-1对小鼠免疫细胞的影响[J].中药药理与临床，2012，28（2）∶45-48.

[2]张红英，王学兵，崔保安，等.山药多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体和T淋巴细胞亚群的影响[J].华北农学报，2010，25（2）：236-238.

[3]刘廷，鞠玉琳，李杨，等.中药复方连黄对小鼠T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的影响[J].四川动物，2009，28（1）：115-117.

[4]屈雪琪，赵建增，梁智选，等.流式细胞术检测不同试验条件对猪T淋巴细胞亚群的影响[J].中国畜牧兽医，2011，38（4）∶101-104.

（编辑：韩斌）

Effecton T cellsubset from pigletand Balb/cm ice ofproanthocyanidin A-1

Liu Yingzi,Dong Xiaoping,Cheng Di,Zhou Tiezhong*
（Liaoning Medical University，LiaoningJinzhou121001）

Proanthocyanidin A-1(PAA-1)was isolated f rom Rhododendron spiciferum in ethylacetate.To prel iminary study the mechanism of immuno-enhancing activity of PAA-1 in cel l level,ratio of two main lymphocyte T subsets(CD4+cel ls and CD8+cel ls)were detected by f low cytometer. The lymphocyte T came f rom mice in vit ro and peripheral blood lymphocyte,thepiglets were fed with PAA-1.The resul ts showed that PAA-1 can elevate the CD4+,CD8+and CD4+CD8+cel l populations alone or with Con A and elevate the ratio of CD4+/CD8+in vit ro,and enhance CD4+,CD8+cel l populations and the ratio of CD4+/CD8+in high dose groups.PAA-1 play a role in immune regulation by increasing the number of T helpers,T cytotoxic/suppressors and promote lymphocyte T maturation.

Proanthocyanidin A-1;T cel l subset;Balb/c mice;Piglet

R285.5

：B

：1672-9692(2014)10-0001-04

2014-09-01

刘英姿（1976-），女，博士，副教授，主要从事中药免疫研究。

周铁忠（1964-），男，博士，教授，研究方向为动物及人兽共患疫病防治。

辽宁省自然科学基金项目：《表儿茶素免疫活性及其对免疫抑制小鼠影响的研究》项目编号：2013022047；辽宁医学院博士科研启动基金项目Y2012B010