牛源A型多杀性巴氏杆菌pm0979和pm0442基因编码蛋白对小鼠的免疫保护性研究

冯思源，马建伟，杜慧慧，李能章，彭远义

(西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 400715)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种能够引起牛、猪、鸡、兔等多种动物产生以出血性败血症或呼吸系统疾病为主要特征的重要病原菌[1]。以往在牛群中流行的主要是以引起出血性败血症为主的荚膜血清B 型，但近年来在牛群中发现的主要是以引起肺部感染为主的荚膜血清A 型[2]。目前牛呼吸系统疾病(BRD)已成为危害养牛业的主要疫病，发病率50 %～100 %，病死率10 %～50 %，Pm A型是导致BRD 临床综合症的主要细菌性病原之一，环境应激尤其是运输应激是其主要诱因。我国自2008 年报道从发病牛群中分离鉴定到多杀性Pm A型以来[3]，因该病原引起的疾病在我国许多省市均有发生，给养牛业造成了严重的经济损失[4]。

由于Pm 血清型众多，不同血清型之间交叉免疫力较低，甚至没有，而我国目前所用疫苗主要是针对引起牛出血性败血症的Pm B 型传统疫苗，对A 型无交叉保护作用[5]，缺乏针对牛Pm A 型的疫苗。目前尚无商品化的有效疫苗上市，需要进一步筛选有效抗原蛋白。本实验室前期实验表明Pm CQ2 株的pm0442 和pm0979 基因在接种的鼠肺脏中大量表达，推测这两个基因在肺脏的大量表达可能对毒力起着关键性的作用[6]。因此，为研究Pm CQ2株pm0979 和pm0442 基因编码的PM0979 和PM0442蛋白的免疫原性，本研究通过原核表达了这两种蛋白，并分别免疫小鼠后以同源菌株攻毒，对其免疫效果进行了评价，为鉴定具有免疫原性的细菌蛋白及亚单位疫苗的研制提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及实验动物 牛源A 型Pm CQ2株、大肠杆菌感受态DH5α 和BL21、牛抗Pm 阳性血清均为本实验室保存；6 周龄昆明小鼠购自重庆中药研究所。

1.2 主要试剂 弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；限制性内切酶Eco R Ⅰ、Xho Ⅰ均购自TaKaRa 公司；DNA Marker、蛋白Marker 和细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自OMEGA。

1.3 引物设计与合成 根据Pm CQ2 株pm0979 和pm0442 基因序列(15601865 和15601865)设计两对引物：pm0979R：5'-GAGTCA CTCGAG TTATTTTGCG TTAGTACAAT-3'(Xho Ⅰ)/pm0979F：5'-GAGTCA GAATTC ATGGTTGCTGGCGCATTAACT-3'(Eco RⅠ)；pm0442R：5'-GAGTCA CTCGAG AATCACTTCTTTTA ACTTCTTCTG-3'(XhoⅠ)/pm0442F：5'-GAGTCA GA ATTC TGTTTTGATAAAGAGAGCAAAG-3'(Eco RⅠ)。引物由上海Invitrogen 公司合成。

1.4 目的基因的PCR扩增及原核表达重组质粒的构建 以Pm CQ2 基因组为模板；PCR 反应体系50 μL；反应条件：95 ℃5 min；95 ℃1 min、57 ℃1 min(pm0442)、72 ℃1 min 30 s、95 ℃1 min、56 ℃1 min(pm0979)、72 ℃1 min 30 s，30 个循环；72 ℃10 min。1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。采用Eco RⅠ和Xho Ⅰ双酶切目的基因pm0979 和pm0442 分别克隆于pET-32a 和pET-30a 质粒中构建重组质粒pET-pm0979 和pET-pm0442，由上海Invitrogen公司测序。

1.5 重组蛋白表达的检测及鉴定 取测序正确的pET-pm0442 和pET-pm0979 转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落，37 ℃振荡培养至OD600nm值0.4～0.6，加入IPTG 至终浓度为l mmol/L，诱导表达3 h，同时设空白载体对照。12 % SDS-PAGE 电泳检测，以5 %脱脂乳1∶16 稀释的牛抗Pm 阳性血清为一抗，以1∶10 000 倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗牛IgG 为二抗，进行western blot 鉴定。采用尿素法裂解菌体，使用Ni-NTA Superflow Cartridge His 亲和层析柱纯化蛋白。纯化后用Bradford 法测定浓度。

1.6 间接ELISA试验 参照文献[7]和[8]间接ELISA 试验的通用方法，并加以改进。以碳酸盐缓冲液将rPM0979、rPM0442 重组蛋白稀释后每孔100 μL(浓度为50 μg/mL)包被酶标板。采用2 % BSA 封闭液，4 ℃封闭过夜，每孔加入1∶200 稀释的待检血清100 μL，37 ℃作用1 h，以羊抗鼠IgG-HRP 为二抗，通过TMB 底物显色，测定OD450nm值进行被检血清检测。

1.7 动物攻毒试验 6 周龄小鼠随机分成3 组，即rPM0442 组、rPM0979 组、PBS 对照组，每组10只。用纯化后的重组蛋白加弗氏完全佐剂乳化后免疫昆明小鼠，多点皮下注射，每只50 μg 重组蛋白。2 周后加强免疫1 次，剂量同上，佐剂改为弗氏不完全佐剂。同时设生理盐水对照组(10 只)。二免后14 d 用2 倍半数致死量(LD50)(LD50为1×107cfu)Pm CQ2 株攻毒，攻毒途径为肌肉注射，攻毒后观察小鼠精神状态，死亡情况。

2 结果

2.1 目的基因的扩增与克隆 以Pm 基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增目的基因。扩增结果显示，PCR 产物分别约为400 bp(pm0979)和700 bp(pm0442)，与预期相符(图1)，并构建重组质粒pET-pm0442 和pET-pm0979，测序结果表明，pm0442和pm0979 基因与原序列的大小完全一致，分别为691 bp 和391 bp，各编码229 和136 个氨基酸。

图1 目的基因的PCR 扩增Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 重组蛋白的原核表达及鉴定 pET-pm0442 和pET-pm0979 经IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 结果显示，重组蛋白rPM0979 和rPM0442 获得表达，其分子量约为41.8 ku 和21.6 ku(图2A)，北且western blot 结果表明，两种重组蛋白具有免疫学活性(图2B)。

图2 pm0442、pm0979 表达产物的SDS-PAGE(A)和western blot(B)鉴定结果Fig.2 SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of the recombinant protein PM0442,PM0979

2.3 ELISA抗体检测结果 分别以rPM0442 和rPM0979 作为包被抗原进行间接ELISA 试验，检测二免10 d 后小鼠血清特异性抗体水平。

结果显示，rPM0442 组和rPM0979 组的小鼠抗体水平基本相同，而对照组的抗体则始终处于较低的水平。rPM0979 组的血清抗体水平显著高于对照组,差异极显著(p<0.01)；rPM0442 组的血清抗体水平显著高于对照组，差异极显著(p<0.01)。rPM0979组的血清抗体水平虽略高于rPM0442 组，但两者之间差异并不显著(p>0.05)(图3)。

图3 免疫小鼠血清抗体水平Fig.3 The assay of serum antibody in mice

2.4 免疫攻毒试验结果 各组实验小鼠于二免后14 d 以Pm CQ2 进行攻毒，结果表明，经rPM0979、rPM0442 免疫后的小鼠均可以在一定程度上抵抗强毒株的攻击，其中以PM0979 重组蛋白的保护效果较好，保护率为60 %，而PM0442 重组蛋白也可以为免疫小鼠提供一定的保护(表1)。

表1 重组蛋白免疫攻毒结果Table 1 Protection of immunized mice against lethal challenge with bovine Pm

3 讨论

近年来，Pm 疫苗的研制重点主要集中于巴氏杆菌的毒力因子。其中，Pm OMPs 中多种成分均具有较好的免疫原性，是研究的热点。有研究表明，Pm 基因pm0979、pm0442 编码的蛋白PM0979 和PM0442 是两个新发现的蛋白[9-10]，但它们的具体功能还未研究清楚。Ren 等研究表明，PM0979、PM0442 可能参与氨基酸的代谢调控，并与营养免疫存在密切关系[11]。Hatfaludi 等研究显示rPM0442为可溶蛋白，具有免疫原性；rPM0979 为不可溶蛋白，具有免疫原性，攻毒试验结果显示，两种蛋白对禽均无保护性[12]。

本研究实现了牛源Pm CQ2 菌株pm0442、pm0979 基因在原核系统中的表达，SDS-PAGE 及ELISA 结果显示：重组蛋白PM0442、PM0979 大小与预期相符，并具有免疫学活性，但动物实验和ELISA 检测表明，rPM0979 与rPM0442 均能够诱导较高的抗体水平，并且抗体水平相当，但rPM0979保护率明显高于rPM0442，可达60%，推测PM0979可能是一种保护性抗原，可作为一种疫苗的候选，但其功能需要进一步的验证。

PM0442、PM0979 在Pm 的致病力方面有着重要作用，但关于这方面的研究较少。因此，对于pm0979、pm0442 基因值得进一步研究。

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