HPLC法测定骨痈内消丸中绿原酸的含量

杨 斌（宜宾市第二人民医院，四川宜宾 644000）

骨痈内消丸系四川省宜宾县骨科医院根据传统验方研制的中药丸剂，由防风、当归、紫花地丁、蒲公英、金银花等20味中药组成，具有清热解毒、消肿溃坚、活血止痛的功效，临床主要用于骨髓炎初期、开放性骨折感染、痛肿疮疡或软组织损伤感染等。方中金银花、蒲公英、紫花地丁等药材均含有绿原酸，为该药的有效成分之一[1-4]。绿原酸又名咖啡单宁酸，化学名为3-O-咖啡酰奎尼酸，是由咖啡酸与奎尼酸组成的羧酚酸，具有多种生物活性，如心血管保护、抗氧化、抗紫外及抗辐射、抗诱变、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖和免疫调节等作用[5-6]。本试验采用高效液相色谱（HPLC）法测定骨痈内消丸中总绿原酸的含量，以期为骨痈内消丸的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司，精度：0.01 mg）。

1.2 药品与试剂

骨痈内消丸（宜宾县骨科医院，批号：130215、131217、140321）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液（8∶92，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。在此色谱条件下，理论板数按绿原峰计不低于5 000；分离度＞1.5。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.绿原酸对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.绿原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.chlorogenic acid control；B.test sample；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品8.78 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.175 6 mg/ml的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液5 ml，置25 ml量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取骨痈内消丸粉末1 000 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，称定质量，85 ℃水浴回流0.5 h，放冷，再次精密称定，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按骨痈内消丸的处方和制剂工艺，制备不含金银花、蒲公英、紫花地丁、当归、栀子、黄连、菌花、防风等8味药材的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样量（x，μg）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得绿原酸的回归方程为y＝3.107×103x－6.913（r＝0.999 9）。结果表明，绿原酸的进样量在0.035 1～0.702 4 μg范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，重复6次，记录色谱图。结果，RSD＝0.3%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一批样品（批号：130215）制成的供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，重复5次，记录色谱图。结果，RSD＝1.8%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：130215）1 000 mg，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，RSD＝1.2%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品500 mg，共9份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入低、中、高浓度的对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 样品含量测定

取3批骨痈内消丸粉末各1 000 mg，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批制备3份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算样品中绿原酸的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

本试验分别采用了甲醇[7]、50%甲醇[8-9]、乙醇、50%乙醇[9]作为提取溶剂，结果50%甲醇提取的绿原酸含量较高，因此选择50%甲醇作提取溶剂。本试验还对提取方法（超声30 min、回流1 h）进行了考察，结果回流1 h测得的绿原酸含量较高。本试验还考察了回流时间（15、30、45、60、90 min），结果显示不同回流时间所测得绿原酸含量差异无统计学意义，为了确保绿原酸提取完全，本试验最终选择了回流30 min。

综上所述，本方法操作简便、迅速，精密度、重复性好，可用于骨痈内消丸中绿原酸的含量测定。

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