RP-HPLC法同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸的含量Δ

邬浩杰，邹盛勤（1.奉化市中医院，浙江 奉化 315500；.宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春

336000）

鹿蹄草为鹿蹄草科植物Pyrola callianthaH.Andres或普通鹿蹄草P.decorataH.Andres的干燥全草，又名鹿衔草、破血丹等，具有祛风湿、强筋骨、止血、止咳等功效，临床上一般用于治疗风湿痹痛、肾虚腰痛、腰膝无力、月经量过多、久劳咳嗽[1]等。现代药理学研究表明，鹿蹄草具有明显的抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降糖、降脂、保护心脑血管等作用[2]。鹿蹄草主要含有醌类、酚类、黄酮类、三萜类等化学成分[3-4]，其中三萜类成分主要为齐墩果酸和熊果酸，两者互为同分异构体，通常以游离或结合为苷的形式广泛存在植物界[5]。齐墩果酸和熊果酸均具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗菌、保肝等功效[6-8]。目前，关于鹿蹄草化学成分的研究报道较多，但同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法则鲜有报道。2010年版《中国药典》（一部）收载的鹿蹄草含量测定项下仅以水晶兰苷的含量为测定指标，而无其主要活性成分三萜酸类的含量测定标准[1]。为此，笔者建立了反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，旨在为鹿蹄草的质量控制和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括515双泵、2996型光电二极管阵列检测器和Empower中文色谱数据工作站（美国Waters公司）；RO-MB-10D型高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D型电子分析天平（德国Sartourius公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科技仪器有限公司）；FY177型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：250 W，频率：59kHz）。

1.2 药材

鹿蹄草购自安徽、云南和江西，经宜春学院陈武教授鉴定为鹿蹄草科植物P.herba的全草。

1.3 试剂

齐墩果酸和熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110742-200314、110709-200304）；甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙醇为分析纯（江西洪都生物化学有限公司）；磷酸为分析纯（上海化学试剂有限公司一厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（88 ∶12 ∶0.15，V/V/V）；流速：0.9 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μl。以齐墩果酸和熊果酸计，理论板数均大于10 000；分离度＞1.9；对称因子分别为1.03和0.99。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.鹿蹄草；1.齐墩果酸；2.熊果酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.P.calliantha；1.oleanolic acid；2.ursolic acid

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品2.31、5.32 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含每1 ml含齐墩果酸0.231 mg和熊果酸0.532 mg的对照品混合溶液。

2.2.2 供试品溶液 取鹿蹄草样品适量，置恒温干燥箱中于70 ℃下干燥6 h，用高速粉碎机粉碎，分别精密称取鹿蹄草样品粉末各约3 g（安徽：3.094 0 g，云南：3.095 4 g，江西宜春：3.095 1 g，江西樟树：3.069 4 g），分别置100 ml具塞锥形瓶中，加95%乙醇50 ml，称定质量，超声提取1 h，冷却，再次称定，用95%乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

用微量注射器分别精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品混合溶液2.0、6.0、10.0、15.0、20.0 μl，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标法进行定量分析。以对照品的进样量（x，μl）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得齐墩果酸的回归方程为y＝5.32×105x－1.06×104（r＝0.999 98），熊果酸的回归方程为y＝5.04×105x－9.07×103（r＝0.999 99）。结果表明，齐墩果酸和熊果酸进样量在0.462～4.60 μg、1.064～10.640 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

分别精密吸取对照品混合溶液10 μl，按上述色谱条件平行进样5次，记录色谱图。结果，齐墩果酸和熊果酸峰的RSD分别为0.9%和0.7%（n均为5），表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一鹿蹄草样品（安徽）6份，每份各约3.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，采用外标法计算样品含量。结果，齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为1.2%和0.9%（n均为6），表明该方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品（江西宜春）溶液，分别于0、2、4、8、12、16、20 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.3%和0.7%（n均为7），表明供试品溶液至少在20 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一鹿蹄草样品（江西宜春）适量，共9份，每份各约1.5 g，按高、中、低质量浓度分别加入齐墩果酸和熊果酸对照品适量，再按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图，重复3次，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 样品含量测定

精密吸取4批鹿蹄草样品（安徽、云南、江西宜春和江西樟树）制备的供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，每批平行测定3份，记录峰面积，计算样品含量。结果，4批样品中齐墩果酸的质量分数分别为0.122 0%、0.098 1%、0.130 3%、0.132 7%（n＝3），熊果酸的质量分数分别为0.566 3%、0.425 7%、0.598 1%、0.6062%（n＝3）。

3 讨论

由本试验结果可知，不同产地的鹿蹄草中两种三萜酸的含量存在一定差异，其中江西樟树产样品中齐墩果酸和熊果酸的质量分数最高，分别为0.132 7%和0.606 2%；云南产样品的质量分数最低，分别为0.098 1%和0.425 7%。

齐墩果酸和熊果酸均属于五环三萜类化合物，结构和极性相似，因此在色谱柱上的保留时间相近而难以完全分离。本试验采用RP-HPLC法，以甲醇-水-磷酸（88 ∶12 ∶0.15，V/V/V）为流动相，同时测定了鹿蹄草中的两种三萜酸类成分齐墩果酸和熊果酸，柱效高，分离度均＞1.9，且峰形对称，可以有效地将两者分开。

综上所述，本方法简单、准确，精密度和重复性良好，可为鹿蹄草药材的质量控制提供科学依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：304.

[2]王军宪，张莉，吕修梅，等.普通鹿蹄草化学成分的研究[J].中草药，2003，34（4）：307.

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