SAFE-GC-MS分析酸牛奶挥发性成分

刘南南，郑福平,2,*，张玉玉,2，范婷婷，黄明泉,2，陈海涛,2，刘玉平,2，谢建春,2，孙宝国,2

（1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

SAFE-GC-MS分析酸牛奶挥发性成分

刘南南1，郑福平1,2,*，张玉玉1,2，范婷婷1，黄明泉1,2，陈海涛1,2，刘玉平1,2，谢建春1,2，孙宝国1,2

（1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

采用溶剂辅助风味蒸发法萃取原味酸牛奶挥发性成分，利用气相色谱-质谱联用法结合保留指数、标准品对照对挥发性成分进行定性分析，采用面积归一化法加邻二氯苯作内标定量，共鉴定出挥发性成分52 种，其中酸12 种、醛2 种、酮5 种、醇2 种、酯3 种、内酯2 种、烯烃4 种、烷烃17 种、其他5 种。其中，对酸牛奶风味影响较大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸稀酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香兰素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸内酯、丁位十二内酯等。

酸牛奶；溶剂辅助风味蒸发；气相色谱-质谱联用；挥发性成分；保留指数；标准品

酸奶由牛奶发酵制成，主要原料是牛 奶、蔗糖和乳酸菌发酵剂，是一种功能独特的营养品，不仅保存了牛奶中所有的营养成分，而且能调节机体内微生物的平衡。由于酸奶具有口味酸甜、细滑的特点，且营养丰富，深受人们的喜爱[1]。酸奶中的风味化合物可能是乳酸菌代谢产生的，这些风味化合物主要来源于乳糖、酯类、柠檬酸或蛋白质（氨基酸）的微生物的代谢，或酶及化学的转变[2]。酸奶中的风味物质主要有挥发性酸、羟基化合物、醇类、酯类等[3]。关于酸奶风味的提取方法，国内外报道较多的为固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法[4-5]。王伟君等[6]采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱（simultaneous distillation extraction and gas chromatography-mass spectrometry，SDE-GCMS）联用技术，测定发酵乳中风味物质；刘宁宁等[7]采用碘滴定法和邻苯二胺比色法测定发酵乳中的乙醛和双乙酰含量；郭文奎等[8]利用SPME-GC-MS联用测定酸奶发酵过程中挥发性风味成分；李宁等[9]用溶剂辅助蒸发（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）、SDE和顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）3 种方法萃取结合GC-MS分析新疆发酵骆驼乳挥发性成分。

SAFE作为一种温和的挥发性成分提取方式，在中高真空和接近室温的条件下，利用水或有机溶剂的快速蒸发，辅助挥发性风味物质的蒸发，除去难挥发组分，得到的萃取物没有“煮熟”味，香味自然逼真[10]，适合液态乳制品等食品中挥发性成分提取[11]。目前关于SAFE提取挥发性成分的研究报道，主要集中在果蔬[12-15]、酒[16]、肉制品[17-18]和乳制品[19]。

本实验采用SAFE装置提取酸牛奶中的挥发性成分，意在解决SPME法萃取挥发性成分过程中由于吸附竞争及萃取纤维头吸附容量受限导致无法有效萃取样品中的痕量挥发性成分的问题[20]，与SDE法相比，萃取条件温和，避免了热敏性挥发性成分的损失，为乳制品及其他液体样品的挥发性成分的分离、分析提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三元原味酸牛奶（180g，袋装）市售，放于冰箱内冷藏备用。

二氯甲烷（分析纯，重蒸后使用）、无水硫酸钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、C7～C30正构烷烃（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；乙酸、丁酸、乙偶姻等标准品（色谱纯） 百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SAFE装置 定制加工；XDS5复合涡轮分子泵英国Edwards公司；N-EVAP111-12位干浴氮吹仪 美国Organomation Associates公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（配MSD ChemStationE.02.01.1177数据处理系统和NIST 11质谱图数据库） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

图1 SAFE装置示意图[21]Fig.1 Schematic view of SAFE equipment[21]

如图1所示，将360 g酸牛奶经滴液漏斗1缓慢滴入蒸馏烧瓶2（1000 mL）内，超级恒温水槽3和循环水的温度均为50 ℃，在冷阱5和冷阱7中加入液氮，分子涡轮泵使系统压力降至5×10-3Pa左右开始滴加样品，滴加约1 h，滴加完成后继续蒸发30 min。待500 mL收集烧瓶6内提取液自然融化后，用50 mL二氯甲烷萃取提取液4次，合并萃取液。无水Na2SO4干燥，过滤，得澄清的二氯甲烷萃取液。旋转蒸发至10 mL，氮吹至0.5 mL备用。

1.3.2 GC-MS分析

色谱柱：DB-WAX毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度50 ℃，以3 ℃/min升到180 ℃，再以6 ℃/min升到230 ℃，保持10 min；载气流速1.0 mL/min；进样量1μL；不分流。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟5 min；质量扫描范围40～450 u。

1.3.3 定性定量分析

定性分析：运用NIST 11谱库检索，保留匹配度不小于60的成分；通过计算保留指数结合文献保留指数进一步对化合物进行定性，对羧酸和其他可能对酸牛奶风味有重要影响到化合物通过标准品进一步定性。

定量分析：采用面积归一化法对各组分进行定量分析，得到各组分的相对含量。进样时，在样品进样后立刻进1 μL 100 μg/mL的邻二氯苯做内标，通过峰面积比值计算各组分含量。

2 结果与分析

图2 酸牛奶挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of volatiles in yogurt

表1中保留了匹配度不小于60，或者文献保留指数与样品保留指数相差30以内，或者有标准品比对的化合物，并认为是可靠的。

从表1可以看出，酸牛奶经SAFE-GC-MS分析，得到的挥发性成分主要是酸类（27.82%）、酮类（28.97%）、醛类（0.28%）、醇类（0.49%）、酯类（0.24%）、内酯类（0.42%）、烯烃类（0.85%）烷烃类（8.93%）及其他类化合物（8.24%）。鉴定出的含量较高的化合物（相对峰面积大于1%）有丁酸、己酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、棕榈酸、乙偶姻、2,6,10,14-四甲基十五烷、二十二烷、2,6-二叔丁基对甲酚、2,4-二叔丁基苯酚。

表1 酸牛奶挥发性成分Table 1 Volatiles identified in yogurt

通常认为酸类作为酸牛奶的主要挥发性物质主要表现在滋味上[22]，也有报道称挥发酸对酸牛奶风味作用不大的结论并不一定正确，它至少对酸牛奶的风味强度有相对较大的影响[23]，是酸牛奶清爽口感的来源[24]。酸牛奶中的脂肪酸源于脂肪的降解。本实验共检测到酸12 种，其中，乙酸具有淡淡的酸味，丁酸具有多汁味、奶油味，己酸有油脂味，辛酸具有清香，癸酸表现出油脂味、腐臭味。检测到不饱和脂肪酸1 种（9-癸稀酸），呈显著脂肪酸和蜡香，略有果香和乳香[25]。另外，有机酸的保健功能也有报道[26]。

酮类物质多由不饱和脂肪酸的氧化、热降解或微生物代谢产生。酮类物质使酸牛奶具有特征的风味。乙偶姻具有令人愉快的奶香气、微甜、乳脂气息，是本实验酸牛奶中含量最高的挥发性成分，文献报道的酸牛奶中乙偶姻含量在1.2～28.2 μg/g，测得量（13.4 μg/g）与文献[27]相符；2-壬酮具有果香、甜香、青香及椰子、奶油的气味；2-十一酮具有蜡香、脂肪香，并带有奶油、乳酪的味道[25]。

检测到醛类2 种。壬醛具有蜡香、脂肪香；香兰素具有甜香、奶油香[25]。

醇类化合物主要来自脂肪氧化，有文献报道饱和醇的风味阈值较高，对整体风味贡献较小，不饱和醇的风味阈值较低，对风味贡献较大[28]。

内酯类化合物，虽然含量较少但阈值较低，对酸牛奶的风味起重要作用。内酯类化合物源于脂肪的降解，由4或5-羟基酸经环化反应生成。丁位癸内酯具有桃子、乳脂香气；丁位十二内酯具有脂肪、奶油、牛奶、坚果的气味[25]。对不同品牌酸牛奶香气成分的研究表明，内酯类化合物可以增添酸牛奶的奶香气息[29]。

硫醇是含硫氨基酸分裂所得，硫醇阈值很小，故硫醇虽含量低，但对风味影响不见得小。

检测到的2,6-二叔丁基对甲酚为食品抗氧化剂，异丙醚、二甲基砜、2,4-二叔丁基苯酚的来源有待进一步研究。

对于文献中报道的酸牛奶中的典型香味成分乙醛，通过SAFE萃取没有检测到，可能是由于GC-MS分析过程中设有溶剂延迟（5 min），根据乙醛的文献保留指数推算出乙醛出峰时间在溶剂延迟以内，被溶剂峰掩盖。

3 结 论

酸牛奶经SAFE萃取、GC-MS分析，得到的挥发性成分主要是酸类（27.82%）、酮类（28.97%）、醛类（0.28%）、醇类（0.49%）、酯类（0.24%）、内酯类（0.42%）、烷烃类（8.93%）及其他类化合物（8.24%）。其中，对酸牛奶风味影响较大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香兰素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸内酯、丁位十二内酯。

实验采用SAFE结合GC-MS分析对酸牛奶的挥发性成分进行分析，克服了同时蒸馏萃取时间长、对热敏性香味成分影响较大的难题。与固相微萃取相比，能够更全面的萃取酸牛奶中的挥发性成分。但是由于溶液萃取、浓缩过程中对沸点较低及含量较低的化合物有一定损失，还需通过与其他萃取手段结合进行深入分析。

[1] 康欢. 酸奶中风味物质与酶活及感官特性关系的初探[D]. 哈尔滨:东北农业大学, 2013.

[2] 郭文奎. 优质酸奶风味图谱的建立[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2012.

[3] 李延华, 王伟军, 张兰威, 等. 发酵乳中风味物质的研究进展[J]. 中国酿造, 2008, 26(14): 8-11.

[4] BESHKOVA D, SIMOVA E, FRENGOVA G, et al. Production of flavour compounds by yogurt starter cultures[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1998, 20(3/4): 180-186.

[5] LUBBERS S, DECOURCELLE N, VALLET N, et al. Flavor release and rheology behavior of strawberry fatfree stirred yogurt during storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(10): 3077-3082.

[6] 王伟君, 李延华, 张兰威, 等. SDE-GC-MS法测定发酵乳中风味物质[J].食品科学, 2008, 29(6): 332-334.

[7] 刘宁宁, 郭红敏, 葛春美, 等. 酸奶中乙醛和双乙酰含量对其风味的影响[J]. 中国食品添加剂, 2012(1): 269-273.

[8] 郭文奎, 王玉堂, 霍贵成. 固相微萃取气质联用测定酸奶发酵过程中挥发性风味成分[J]. 中国乳品工业, 2012, 40(6): 58-61.

[9] LI Ning, ZHENG Fuping, CHEN Haitao, et al. Identification of volatile components in Chinese Sinkiang fermented camel milk using SAFE, SDE, and HS-SPME-GC/MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1242-1252.

[10] HAVEMOSE M S, JUSTESEN P, BREDIE W L P, et al. Measurement of volatile oxidation products from milk using solvent-assisted flavour evaporation and solid phase microextraction[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(7): 746-752.

[11] BENDALL J G. Aroma compounds of fresh milk from New Zealand cows fed different diets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4825-4832.

[12] XU Yan, FAN Wenlian, QIAN M C. Characterization of aroma compounds in apple cider using solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(8): 3051-3057.

[13] 何聪聪, 刘梦雅, 刘建彬, 等. SPME和SAFE结合GC-O-MS分析鲜榨西瓜汁挥发性香气成分[J]. 食品工业科技, 2014, 35(2): 49-53.

[14] MAJCHER M, JELEŃ H H. Comparison of suitability of SPME, SAFE and SDE methods for isolation of flavor compounds from extruded potato snacks[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2009, 22(6): 606-612.

[15] MURAT C, GOURRAT K, JEROSCH H, et al. Analytical comparison and sensory representativity of SAFE, SPME, and purge and trap extracts of volatile compounds from pea flour[J]. Food Chemistry, 2012, 135(3): 913-920.

[16] MO Xinliang, XU Yan, FAN Wenlian. Characterization of aroma compounds in Chinese rice wine Qu by solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(4): 2462-2469.

[17] 段艳, 郑福平, 杨梦云, 等. ASE-SAFE/GC-MS/GC-O分析德州扒鸡风味化合物[J]. 中国食品学报, 2014, 14(4): 222-230.

[18] 段艳, 郑福平, 王楠, 等. MAE-SAFE/GC-MS分析酱牛肉挥发性成分[J].食品科学, 2013, 34(14): 250-254.

[19] 李宁, 郑福平, 杨梦云, 等. SAFE用于液态奶味香精挥发性香成分的提取效果[J]. 食品科学, 2010, 31(18): 347-349.

[20] 徐刚, 史茗歌, 吴明红, 等. 固相微萃取的原理及应用[J]. 上海大学学报: 自然科学版, 2013, 19(4): 368-373.

[21] ENGEL W, BAHR W, SCHIEBERLE P. Solvent assisted flavour evaporation: a new and versatile technique for the careful and direct isolation of aroma compounds from complex food matrices[J]. European Food Research and Technology, 1999, 209: 237-241.

[22] 葛武鹏, 李元瑞, 陈瑛, 等. 牛羊奶酸奶挥发性风味物质固相微萃取GC/MS分析[J]. 农业机械学报, 2009, 39(11): 64-69.

[23] 刘景, 张雪洪, 王荫榆. 酸奶保质期内风味物质与风味变化研究[J].食品工业科技, 2011, 32(7): 154-156.

[24] COLLINS E B. Biosynthesis of flavor compounds by microorganisms[J]. Journal of Dairy Science, 1972, 55(7): 1022-1028.

[25] 孙宝国. 食用调香术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003: 172-179; 299-301.

[26] 张晓梅, 艾娜丝, 孙宝国, 等. 马奶蒸馏酒中挥发性成分分析[J]. 中国食品学报, 2013, 13(11): 160-168.

[27] CHENG Hefa. Volatile flavor compounds in yogurt: a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50(10): 938-950.

[28] 谢建春. 现代香味分析技术及应用[M]. 北京: 中国标准出版社, 2008: 17-18.

[29] 牛云蔚, 肖作兵, 张喆, 等. 不同品牌酸奶香气成分研究[J]. 粮食与油脂, 2013, 26(9): 49-52.

Analysis of Volatiles in Yogurt by Solvent-Assisted Flavor Evaporation and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Nan-nan1, ZHENG Fu-ping1,2,*, ZHANG Yu-yu1,2, FAN Ting-ting1, HUANG Ming-quan1,2, CHEN Hai-tao1,2, LIU Yu-ping1,2, XIE Jian-chun1,2, SUN Bao-guo1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Volatiles in plain yogurt were extracted by solvent-assisted flavor evaporation (SAFE) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) by combination of their retention indices with those of standards. Area normalization method was used for quantitative analysis and 1,2-dichlorobenzene was used as internal standard. A total of 52 volatiles were identified, including 12 acids, 2 aldehydes, 5 ketones, 2 alcohols, 2 lactones, 3 esters, 4 olefins, 17 hydrocarbons, and 5 other compounds. The main volatile flavor constituents in yogurt i ncluded acetic acid, butanoic acid, hexanoic acid, octanoic acid, n-decanoic acid, 9-decenoic acid, acetoin, 2-nonanone, 2-undecanone, nonanal, vanillin, 3-methyl-2-buten-1-ol, 1-hexadecanethiol, delta-decalactone, and delta-dodecalactone.

yogurt; solvent-assisted flavor evaporation (SAFE); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); volatiles; retention indices; standards

TS252.5

A

1002-6630（2014）22-0150-04

10.7506/spkx1002-6630-201422028

2014-06-30

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100903）

刘南南（1991—），女，硕士研究生，研究方向为香料化学。E-mail：liunan_0315@126.com

*通信作者：郑福平（1969—），男，教授，博士，研究方向为香料化学。E-mail：zhengfp@th.btbu.edu.cn