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海星皂苷测定条件优化及其组织分布测定

2014-03-08殷邦忠

食品科学 2014年24期
关键词:海星浓硫酸定容

曹 荣,张 媛,赵 玲,殷邦忠,刘 淇,*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛 266071;2.獐子岛集团股份有限公司,辽宁 大连 116001)

海星皂苷测定条件优化及其组织分布测定

曹 荣1,张 媛2,赵 玲1,殷邦忠1,刘 淇1,*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛 266071;2.獐子岛集团股份有限公司,辽宁 大连 116001)

为了建立快速、简便、准确的海星皂苷含量检测方法,以多棘海盘车为研究对象,分析浓硫酸用量、反应温度、反应时间等比色条件以及脱色、脱脂等样品前处理条件对测定结果的影响,并采用优化后的检测方法对多棘海盘车不同组织中的皂苷含量进行测定。结果表明:适宜采用浓硫酸用量10%、反应温度60 ℃、反应时间30 min的比色条件,样品前处理过程中进行脱色、脱脂以及丙酮沉淀可以显著提高测定的准确性。精密度实验和加标回收率实验结果表明:皂苷含量低、中、高3 组样品对应的相对标准偏差分别为4.71%、1.61%和1.52%,平均加标回收率为99.64%,该方法的精密度和准确性可以满足检测要求。多棘海盘车整体皂苷含量为3.65 mg/g(干基计),其中消化腺中皂苷含量最高,其次是体壁和生殖腺。

皂苷;多棘海盘车;比色法

海星属于棘皮动物门(Echinodermata),海星纲(Asteroidea),是一类海洋底栖的无脊椎动物,在我国沿海海域分布广泛[1]。海星大量掠食牡蛎、扇贝等,且具有很强的繁殖和再生能力,严重危害沿海的贝类养殖。目前贝类底播养殖区域的海星随拖网起捕后多被直接丢弃或经曝晒粉碎后用作农作物肥料,这对环境是一种污染,也造成了资源的浪费。

海星具有较高的蛋白、脂质含量[2],同时含有皂苷、甾醇、生物碱、多糖等多种结构独特的化学物质[3],在食品、饲料、医药等领域具有良好的开发前景。海星皂苷是海星的次生代谢产物,具有重要的生物功能和药理活性,如调节生殖发育、降血压、抗溃疡、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长等,但同时也具有很强的溶血作用与毒性[4],人或动物过量服用后会产生头晕、呕吐等中毒症状,因此海星用作食品和饲料加工时具有一定的安全隐患[5],针对海星中皂苷检测方法和脱除技术的研究具有重要的现实意义。

目前皂苷的分析方法主要有比色法、薄层扫描法、色谱法、毛细管电泳法等[6]。不同类型的皂苷,其适用的检测方法也不同。海星中的皂苷多以甾体化合物的形式存在[7],利用其可被浓硫酸氧化脱水生成α,β-不饱和酮共轭体系的性质[8],可以采取紫外分光光度法测定其含量[9],但该方法的准确性和稳定性会受到样本中脂质、色素、游离糖及部分水解苷元等的影响,因此有必要对该方法的测定条件进行优化。

本实验以薯蓣皂苷元作为标准品,分析了浓硫酸用量、反应温度、反应时间对比色的影响,并以黄海和渤海较为常见的海星——多棘海盘车(Asterias amurensis)为研究对象,考察皂苷提取过程中脂质脱除、色素脱除以及水解苷元分离对测定结果的影响,对基于紫外分光光度法的海星中皂苷定量检测条件进行优化,并采用该方法对多棘海盘车中的皂苷分布进行了分析,以期为海星的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多棘海盘车由大连獐子岛集团股份有限公司提供,2013年5月采集自渤海獐子岛海域,选取辐径(12±2) cm的样品,洗净后烘干、粉粹,过200 目筛备用。

薯蓣皂苷元标准品 美国Sigma公司;浓硫酸、甲醇、丙酮、石油醚等均为分析纯。

1.2 方法

专业核心课是财务管理专业的重要内容,教师通过核心课能够将财务管理知识系统的传授给学生,这样学生就会具备实际操作的能力。核心课设置如下课程:财务管理案例、财务控制、税法与筹划等,我们可以将预算管理、高级财务管理、资本运营、非营利组织财务等课程作为选修课供学生选择学习。这样也就体现了财务管理专业具备的独特性。其中,中级财务会计、财务管理、财务管理案例、财务风险管理、税法与筹划、财务控制、财务分析、成本管理会计、资产评估是专业核心课的重要内容。

1.2.1 溶液的配制

取50.0 mg于50 mL容量瓶中,甲醇定容,配制成1.0 mg/mL薯蓣皂苷元甲醇标准溶液。

以陕西办事处、南阳办事处、邯郸办事处、胶东办事处、豫东办事处、晋南办事处、福建办事处,广西办事处、四川办事处、山西省社会化服务体系为根据地,打造的十大现代农业技术服务的探索基地和价值营销的实践基地,形成了天脊品牌提升的重要基点和“市场堡垒”。

当浆液扩散方位角θ≤90°时,即浆液运动方向与裂隙面倾斜方向总体一致,随着裂隙倾角的增大,在相同时间内的注浆压力较小,这是由于裂隙面倾斜时,浆液具有向下的自重分量,其与注浆压力一起克服浆液阻力,促使浆液向下运动,在恒速率注浆情况下,裂隙倾角越大,注浆压力越小,且当注浆时间t=60 s时,浆液扩散方位角θ=0°、倾角α=90°时的倾斜裂隙注浆压力为水平裂隙的0.62倍。

1.2.2 比色条件优化

1.2.2.1 吸收波长的确定

标准品薯蓣皂苷元与浓硫酸反应后,在200~1 000 nm范围内进行光谱扫描,发现在紫外光区有强吸收,其中271 nm波长处有最大吸收峰。这与文震等[9]发现标准皂苷与浓硫酸反应产物在277 nm有最大吸收峰以及王荣镇等[10]发现紫蛇尾皂苷检测波长为276 nm的结论基本一致。

国防科技工业主要是指从事武器科研装备生产、研发工作的相关工业产业,具体包括航空、航天、核能、电子、船舶等多个部门,其对于我国国防事业的建设与发展有着直接的影响。在计划经济时期,军工企业本身所存在的竞争压力非常之小,同时国家的资金支持力度也比较大,因而对于自身的竞争优势以及经济收益问题并不重视[1]。然而随着市场经济的不断发展,军工企业要想生存并长期发展下去,就必须要尊重市场规律,参与到市场竞争中来,不断提升自身的核心竞争力,而市场导向下的军民融合发展策略则恰恰能够帮助军工企业实现这一目标。因此,军工企业的军民融合发展,在很大程度上也是为了满足市场经济环境下国防科技工业的进一步发展需求。

1.2.2.2 硫酸用量

准确量取0.1 mL标准皂苷溶液,于冰水浴中分别加入浓硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,混匀,60℃水浴中反应30 min,冰浴冷却后用甲醇定容至10 mL,测定吸光度。

2.2 反应条件对吸光度的影响

标准皂苷溶液0.1 mL中分别加入浓硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,在同样温度条件下反应相同时间,反应后吸光度见图1a。0.2、0.5 mL和1.0 mL浓硫酸用量对应的吸光度有显著性差异(P<0.01),1.0、2.0、3.0 mL浓硫酸用量对应的吸光度无显著性差异(P>0.05)。从经济和实验安全的角度,采用浓硫酸用量1.0 mL(即浓硫酸用量为反应总体系的10%)。

1.2.2.4 反应时间

准确量取0.1 mL标准皂苷溶液,于冰水浴中加入浓硫酸1.0 mL,混匀,60 ℃水浴中分别反应10、20、30、40、50、60 min,冰浴条件下冷却后用甲醇定容至10 mL,测定吸光度。

1.2.3 样品处理

广汽本田首款纯电动SUV VE-1全球首发,市场指导价22.58万元,补贴后价格为17.08万元起。同时,广汽本田首款插电式混动SUV世锐也于车展亮相并揭晓市场指导价:豪华版20.68万元、补贴后价格18.08万元起;精英版19.68万元,补贴后价格17.08万元起。

1.2.4.2 精密度实验

1.2.4 方法精密度、准确性验证

1.2.4.1 标准曲线绘制

上海诚达物流作为第三方运输公司,提供专业的第三方运输服务。但与运输相关的其他第三方物流服务并有涉及,导致了上海诚达物流公司服务产品的单一性。

分别取薯蓣皂苷元-甲醇标准溶液(1.0 mg/mL)0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL,冰浴条件下分别加入浓硫酸1.0 mL,60 ℃条件下反应30 min,冰浴冷却,甲醇定容至10 mL。于271 nm波长处测定吸光度。

取6 份海星干粉,每份5.0 g,分别加入甲醇100 mL,超声提取60 min,过滤。滤液分别进行如下处理:Ⅰ滤液用甲醇定容至100 mL,直接取0.5 mL,按1.2.2节优化后的条件进行比色;Ⅱ滤液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脱色,充分混匀后滤纸过滤,滤液用甲醇定容后比色;Ⅲ滤液中按照1∶2(V/V)的比例加入石油醚,采用分液漏斗脱除脂质,收集下层液体用甲醇定容后比色;Ⅳ滤液中加入5 倍体积丙酮,8 000 r/min离心20 min后,弃上清液,黄色沉淀物用甲醇溶解、定容后比色;Ⅴ滤液依次脱色、脱脂处理后,甲醇定容比色;Ⅵ滤液依次脱色、脱脂、丙酮沉淀处理后,甲醇定容比色。

设置皂苷含量低、中、高3 组样品(分别取海星干粉1.00 、4.00 g和7.00 g),按照1.2.2节优化的条件进行样品处理,提取粗皂苷并测定含量。每组均重复3次,每次设2个平行。结果以平均值±标准偏差表示,以相对标准偏差表征精密度。

1.2.4.3 加标回收率实验

取已知皂苷含量的海星干粉样品6份,每份1.00 g,按照1.2.2节优化的条件进行样品处理,然后分别加入5.0 mg/mL薯蓣皂苷元标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,定容后比色。计算各组加标回收率,以平均加标回收率表征准确性。

1.2.5 多棘海盘车不同组织中皂苷含 量测定

答:85岁的老人,吃点东西就要上厕所,肚里存不住东西,到医院检查没有病,说明肠道功能老化,属于功能问题,可服用水苏糖、活菌制剂和植物活性硒,调节肠道功能。

鲜活多棘海盘车洗净泥沙,分离出体壁、消化腺(包括胃、幽门盲囊)和生殖腺,烘干,研成粉末备用。分别取体壁、消化腺和生殖腺干粉5.0 g,按照1.2.2节和1.2.3节确立的条件进行皂苷提取和含量测定。

1.3 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 吸收光谱

1998年,地处松嫩平原的巨浪牧场连降暴雨,本已四处漏风的泥草房再也经不起暴风雨的洗礼,一整面墙突然倒塌。无奈之下,全家只好紧急疏散,被牧场安置到场部西侧一个叫“西牛舍”的地方。

准确量取0.1 mL标准皂苷溶液,于冰水浴中加入浓硫酸1.0 mL,混匀,60 ℃水浴中反应30 min,冰浴冷却后用甲醇定容至10 mL。用紫外-可见分光光度计在200~1 000 nm波长范围内进行光谱扫描。

1.2.2.3 反应温度

准确量取0.1 mL标准皂苷溶液,于冰水浴中加入浓硫酸1.0 mL,混匀,分别在20、40、60、80℃、水浴中反应30 min,冰浴冷却后用甲醇定容至10 mL,测定吸光度。

标准皂苷溶液0.1 mL中加入浓硫酸1 mL,分别在20、40、60、80 ℃水浴中反应30 min,反应后的吸光度见图1b。随着反应温度的升高,吸光度呈增大的趋势。20 ℃对应的吸光度明显低于其他组(P<0.01),说明20 ℃条件下皂苷与浓硫酸反应不完全。60 ℃对应的吸光度略高于40 ℃(P<0.05),60、80 ℃对应的吸光度之间差异不显著(P>0.05)。因此,60 ℃适宜作为反应温度。

自主、合作、探究式学习是新课程改革所极力倡导的学习方式。在这种学习方式之下,学生的自主学习是基础。通过学生的自主学习,我们才能很准确地收集学生在自主学习过程中所遇到的困难,才能为接下来的“以学定教”提供教学决策,使得课堂教与学沿着正确的方向前进。但是课堂教学是不能仅仅停留在学生的自主学习环节的,因为这样的话学生只是发现了问题,却没能很好地解决问题。因此,从教学的实际效果上来说还是远远不够的。所以说,合作、探究环节才是新课程改革之下一堂课的最主要环节。通过这个环节,教师的教学目标才能实现,课堂教学的重难点才能得到有效突破,学生的个性化学习成果也才能有所保障。

目前的小学英语课标没有具体规定小学阶段的音标学习要到何种程度,教学目标只在于带领孩子们感受拥有同样元音发音规律的单词,并没有进行系统的音标教学。可是近几年小学英语测试中开始出现音标考察题,比如选出划线部分读音不同的单词这种类似的题型,一般是10分的分值,而大部分孩子都会丢掉4-8分。丢分太多,孩子们纷纷对音标题“发怵”。

标准皂苷溶液0.1 mL中加入浓硫酸1 mL,在60 ℃水浴中分别反应10、20、30、40、50、60 min,反应后的吸光度见图1c。随着反应时间的延长,吸光度呈增大的趋势,30 min以后吸光度趋于平稳。因此,反应时间控制为30 min。

图1 不同浓硫酸用量(a)、反应温度(b)、反应时间(c)条件下的吸光度Fig.1 Absorbance as a function of sulfuric acid dosage (a), reaction temperature (b) and reaction time (c)

2.3 样品处理条件对比色结果的影响

1.2.2 平衡指数测定方法 仪器采用以色列Sunlight医疗器械公司Tetrax平衡测试系统。平衡指数是由Tetrax测得的平衡参数计算出的一个用以表示患者跌倒风险的数值,这个值基于各种影响患者平衡的因素。测定方法简单无伤害,患者站在平衡测定仪上,通过8种姿势对患者进行测量,包括在自然站立情况下睁眼、闭眼、头左右和前后专向,左右脚步同步性和脚下垫有泡沫橡胶脚垫等,5~10 min测定完毕,由专职治疗师完成所有的检测。检查前向受检者充分解释检查目的和注意事项,检查时尽量保持检测环境的安静。测定结果以姿势的总结表(BSS)和平衡指数的形式表示。

图2 样品前处理方式对吸光度的影响Fig.2 Effects of sample pretreatment methods on absorbance

由图2可知,海星样品脱色、脱脂及丙酮沉淀处理对吸光度均有一定的影响,其中活性炭脱色处理影响显著(P<0.05),脱脂、丙酮沉淀处理影响均极显著(P<0.01)。海星样品用甲醇提取粗皂苷过程中,部分脂质、色素、游离糖及部分水解苷元等会一并溶出,且都可能与浓硫酸发生反应,造成吸光度增大,进而影响检测的准确性。Ⅵ组样品经脱色、脱脂、丙酮沉淀处理后,吸光度为0.202,与对照Ⅰ组的吸光度0.376相比,明显降低。

贵州中部长顺苹果产区雨水多光照差,建议套袋栽培,有利于果实着色,隔离药剂,提高品质。而威宁地区,紫外线强,果面光洁度较差,外观品质差,但能保证果实品质,可根据市场需求选择性套袋。建议有技术条件的区域进行无袋栽培。

2.4 标准曲线

以薯蓣皂苷元作为标准品,绘制标准曲线。溶液中皂苷质量分数在2~40 μg/mL范围内与吸光度呈线性相关,其回归方程式为:Y=0.022X+0.001 8,相关系数R2=0.999 8。以吸光度0.01对应的皂苷质量分数为检测限,计算出最低检测限为0.37 μg/mL。

2.5 精密度与加标回收率精密度实验和加标回收率实验结果见表1、2。皂苷含量低、中、高3组样品对应的相对标准偏差分别为

表1 精密度实验结果Table 1 Results of precision experiments

表2 样品加标回收率实验结果Table 2 Results of spiked recovery experiments

4.71 %、1.61%和1.52%,说明方法精密度高、重复性好。平均加标回收率为99.64%(相对标准偏差为1.72%),说明方法准确性高。

2.6 多棘海盘车中皂苷的组织分布

表3 多棘海盘车各组织中海星皂苷含量(以干基计)Table 3 Saponin contents in different tissues of Asterias amurensis

采用建立的检测方法测定多棘海盘车中皂苷的组织分布。由表3可知,体壁、消化腺和生殖腺中皂苷含量有极显著差异(P<0.01)。其中,消化腺中皂苷含量最高,其次是体壁和生殖腺。

3 讨 论

多棘海盘车中皂苷组织分布的检测结果与Kicha等[11]研究结果类似,Kicha等[11]采用高效液相色谱法测得海燕(Asterina pectinifera)中甾体物质含量的分布规律为:幽门盲囊>胃>体壁>性腺。郭承华等[12]测得罗氏海盘车幽门盲囊、胃、体壁、生殖腺的皂苷含量分别为4.16、3.04、1.54、0.24 mg/g,同样是幽门盲囊中含量最高。Garneau等[13]测得北极海星(Leptasterias polaris)中皂苷含量分布规律为:胃>幽门盲囊>体壁>性腺。这些研究均表明海星消化腺(胃、幽门盲囊)中具有较高的皂苷含量,这种现象可能与海星独特的生理有关,相关机理有待进一步研究。

不同的海星种类,其皂苷含量有较大差异。如郭承华等[12]测得罗氏海盘车和海燕中的皂苷含量分别为0.70 mg/g和5.17 mg/g。即使同一种类的海星,其皂苷含量也可能因为地理分布、生长季节等因素存在差别。实验发现,渤海产多棘海盘车整体皂苷含量为3.65 mg/g,这一结果与王长云等[5]测得多棘海盘车粗总皂苷含量为0.077%的结论有很大差异。这种差异一方面与样品的地域性、季节性有关,更重要的可能与测定过程采用的方法不同有关。如张立新等[14]采用香草醛-硫酸显色方法,测得海燕中的皂苷含量为0.313 mg/g,这一结果与郭承华等[12]采用甲醇提取、干燥后称重法测定的海燕皂苷含量5.17 mg/g相差十余倍。

海星中的皂苷在化学结构上多属于甾体皂苷,香草醛-硫酸显色法适用于典型的三萜皂苷,用该方法测定海星中的甾体皂苷时会因为草醛显色后在可见光区没有明显的吸收峰而导致结果偏低。而称重法过程繁琐,测定周期长。相对而言,比色法更为快速、简便,对比色条件进行优化后准确率也较高,完全可以满足日常科研的需要。

选用高产抗病虫良种,供试水稻品种为湘优109、威优431、协优57、宜香481和川江优527等,实行种子处理,采取旱育稀植,培育无病虫壮秧。进行行规范化宽窄行栽插,合理施肥,科学管理,水稻生产全程实行健身控害栽培,严禁使用化学除草剂,创造有利于稻、鸭良好的生存条件。

4 结 论

采用分光光度法可以准确测定海星中的皂苷含量。优化后的提取和前处理条件为:海星干粉按照0.05 g/mL的比例加入甲醇,超声提取60 min,过滤;滤液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脱色,之后按照1∶2(V/V)的比例加入石油醚脱除脂质,收集下层液体加入5 倍体积丙酮,8 000 r/min离心20 min后,弃上清液,黄色沉淀物用甲醇溶解并定容至100 mL,比色。优化后的比色条件为取上述皂苷溶液0.5 mL,冰浴条件下加入浓硫酸1.0 mL,60 ℃条件下反应30 min,冰浴冷却,甲醇定容至10 mL;在271 nm波长处测吸光度。精密度和加标回收率实验表明,该方法可以快速、准确测定海星总皂苷含量。采用上述方法测得多棘海盘车皂苷含量为3.65 mg/g(以干基计),其中消化腺中皂苷含量最高,其次是体壁和生殖腺。

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Optimization of Experimental Conditions for the Analysis of Tissue Distribution of Saponin in Asterias amurensis

CAO Rong1, ZHANG Yuan2, ZHAO Ling1, YIN Bang-zhong1, LIU Qi1,*
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Zhangzidao Group Co. Ltd., Dalian 116001, China)

The objective of this study was to establish a rapid, simple and accurate colorimetric method for the determination of saponin in starfi sh. Asterias amurensis was selected as the raw materials. The effects of colorimetric conditions such as sulfuric acid dosage, reaction temperature and reaction time as well as sample preparation procedures such as decoloration and degreasing on saponin determination were analyzed. It was shown that addition of sulfuric acid in a proportion of 10% (V/V) and reaction temperature at 60 ℃ for 30 min were suitable colorimetric conditions, and the pretreatment steps decoloration, degreasing and acetone precipitation could signifi cantly improve the accuracy of determination. The results of precision and spiked recovery experiments showed that RSDs (relative standard deviations) for three groups with low, medium and high saponin contents were 4.71%, 1.61% and 1.52%, respectively, and the average recovery was 99.64%. Asterias amuren sis was detected to contain 3.65 mg/g saponin (dry basis). The digestive gland of Asterias amurensis showed the highest saponin content, followed by the body wall and gonad.

saponin; Asterias amurensis; colorimetric method

TS254.7

A

1002-6630(2014)24-0174-04

10.7506/spkx1002-6630-201424033

2014-02-17

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(20603022011005)

曹荣(1981—),男,副研究员,博士,主要从事水产品品质评定与控制技术研究。E-mail:caorong@ysfri.ac.cn

*通信作者:刘淇(1965—),男,研究员,本科,主要从事水产品加工研究。E-mail:liuqi@ysfri.ac.cn

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