亳州栽培知母最佳采收期研究

俞年军，马义雯，于 娇，郑太华，雷学强，陈子海

（1.安徽中医药大学药学院 现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥 230031；2.安徽海鑫药业有限公司，安徽亳州 236800）

亳州栽培知母最佳采收期研究

俞年军1，马义雯1，于 娇1，郑太华2，雷学强2，陈子海2

（1.安徽中医药大学药学院 现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥 230031；2.安徽海鑫药业有限公司，安徽亳州 236800）

目的 考察亳州栽培知母的最佳采收时间。方法 采用高效液相色谱－紫外光谱法和高效液相色谱－蒸发光散射检测器测定不同采收期知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量。测定芒果苷的流动相为乙腈－0.1％磷酸水溶液（15∶85），流速为0.8ml／min，柱温25℃，检测波长为317nm；测定知母皂苷BⅡ的流动相为乙腈－水（25∶75），流速为1.0ml／min，柱温25℃；蒸发光散射检测器的漂移管温度为60℃，载气压力30 N／cm2。结果 不同采收期知母药材中芒果苷含量为1.10％～5.28％，知母皂苷BⅡ含量为0.22％～8.68％。结论 11月份是亳州栽培知母的最佳采收期，其芒果苷和知母皂苷含量最高。

知母；高效液相色谱法；芒果苷；知母皂苷；采收期

中药知母为百合科知母属多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴润燥的功效，用于烦热消渴、骨蒸痨热、肺热咳嗽、大便燥结、小便不利等症［1］。在野生知母药材资源日益减少、不能满足需求的情况下，栽培知母是药材的主要来源。安徽亳州是栽培知母的主要产区之一，大规模人工栽培已经有30多年的历史，种植面积每年保持在4～5万亩。为了了解亳州栽培知母药材的质量，掌握亳州栽培知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ的积累变化规律，确立亳州知母的最佳采收时间，笔者采用高效液相色谱法研究知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ含量的变化规律，为亳州知母规范化采收加工提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－20AB型高效液相色谱仪、SPDM20A型检测器、LC Solution N2010色谱工作站：日本岛津；SEDEX 75型蒸发光散射检测器：法国Sedere公司；AS－20500A型超声波清洗器：瑞士Buchi公司。

1.2 试药 芒果苷（BZP0309）、知母皂苷BⅡ（BZP0338）：由北京华迈科生物技术有限责任公司提供；乙腈为色谱纯：美国Tedia试剂公司；水为娃哈哈纯净水：安徽巢湖哇哈哈饮料有限公司；其他试剂为分析纯。

1.3 药材 知母药材样品采自安徽省亳州十九里安徽海鑫中药饮片公司种植基地，2010年3—11月份（1、2、12月份为亳州霜冻期，不易农作）选择两年生知母种植地，每月15日定时采挖并予干燥处理。知母药材经安徽中医药大学中药与资源教研室刘守金教授鉴定为百合科植物知母A.asphodeloides Bge.的干燥根茎。

2 方法和结果

2.1 芒果苷的含量测定［2－6］

2.1.1 色谱条件：色谱柱为Ultimate XB－C18（250 mm×416mm，5μm）；流动相为乙腈－0.1％磷酸水溶液（15∶85）；流速为0.8ml／min；柱温为25℃；检测波长317nm；进样10μl。

2.1.2 对照品溶液的制备：精密称取芒果苷对照品适量，加甲醇制成0.270mg／ml的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试液溶液的制备：干燥知母药材粉碎后过30目筛，取粉末0.1g，精密称定，加入50％乙醇25 ml，浸泡过夜，称质量，超声提取40min，补足质量。过滤，取滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系考察：分别吸取对照品溶液2、4、6、8、10μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以芒果苷的峰面积为纵坐标，以芒果苷的质量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y＝34 135x－62 056，r＝0.999 8，表明芒果苷在0.540～2.700 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 稳定性实验：取同一供试品溶液进行实验，在2、4、6、8、10h各进1针，每次进样10μl，测定芒果苷峰面积平均值，结果RSD＝0.834％，表明样品在10h内稳定。

2.1.6 精密度实验：精密吸取供试品溶液10μl，连续进样5次，测定，计算得芒果苷色谱峰峰面积的平均值，RSD＝1.05％。

2.1.7 重复性实验：取同一批次的知母药材5份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定芒果苷峰面积平均值，结果RSD＝1.26％。

2.1.8 加样回收实验：采用加样法进行回收率考察。精密称取0.1g药材粉末（2010年10月烘干样品，含量1.25％）3份，分别精密加入芒果苷对照品储备液1.25、2.50、3.75μg，按照上述方法制备供试液并测定，计算回收率。结果表明高、中、低3个加入量的回收率都较高，平均达到99.26％，结果RSD＝1.90％。

2.1.9 芒果苷含量测定：取知母样品，按“2.1.3”项的方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，以外标法计算含量，测定芒果苷含量的图谱。见图1、表1。

图1 芒果苷对照品（A）、知母样品（B）高效液相色谱图

2.2 知母皂苷BⅡ含量测定［7－9］

2.2.1 色谱条件：色谱柱为Ultimate XB－C18（250 mm×416mm，5μm）；流动相为乙腈－水溶液（25∶75）；流速为1.0ml／min；柱温为25℃，蒸发光检测器的漂移管温度60℃，载气压力30N／cm2；进样20μl。

2.2.2 对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品适量，加甲醇－30％乙腈制成0.400mg／ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备：干燥知母药材粉碎后过30目筛。取知母粉末0.2g，加入25ml 70％的乙醇，浸泡过夜，称质量，超声提取40min，补足质量。过滤，取滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 线性关系考察：分别吸取对照品溶液5、10、15、20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以皂苷BⅡ的峰面积的自然对数为纵坐标，以皂苷BⅡ质量的自然对数为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y＝1.152 8x＋11.133 0，r＝0.999 6，表明皂苷BⅡ在2.00～8.00μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 稳定性实验：取同一供试品溶液进行实验，在2、4、6、8、10h各进1针，每次进样20μl，测定皂苷BⅡ含量平均值，RSD＝2.42％。结果表明样品在10h内稳定。

2.2.6 精密度实验：精密吸取供试品溶液20μl，连续进样5次，测定，计算皂苷BⅡ色谱峰峰面积的平均数，结果RSD＝2.98％。

2.2.7 重复性实验：取同一批次的知母药材5份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定知母皂苷BⅡ含量平均值，结果RSD＝2.22％。

2.2.8 加样回收实验：精密称取0.2g药材粉末（2010年7月样品，含量0.22％）5份，分别精密加入知母皂苷BⅡ对照品储备液20、40、60、80、100 μl，按照上述方法制备供试液并测定，计算回收率。结果表明5个加入量的回收率都较高，平均达到101.4％（RSD＝1.12％）。

2.2.9 知母皂苷BⅡ含量测定：取知母样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，以外标法计算含量，测定知母皂苷BⅡ的图谱和结果见图2、表1。

图2 知母皂苷BⅡ对照品（A）、知母样品（B）高效液相色谱图

表1 不同采收时间知母药材中芒果苷和皂苷BⅡ含量（n＝2）

3 讨论

由表1可见，从3月份到11月份亳州知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ含量呈动态变化，其中芒果苷和知母皂苷BⅡ在一个生长季中分别出现2个高峰。芒果苷含量高峰出现在7月份和11月份，知母皂苷BⅡ含量高峰出现在3月份和11月份，说明不同采收时间对亳州知母药材质量有较大的影响。由于5月份为知母地上部分迅速生长期，9月份以后是知母地下增重时间，因此，3月份和7月份不适宜知母的采收，11月份知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷含量均高，11月份知母已基本停止生长，所以11月份采收比较适宜。一般认为知母在种植两年后，选择春秋二季均可以采收，但结合亳州种植生产实际，12月份、1月份、2月份为亳州最冷时间，农民采挖较难，产地加工不易晒干。综合考虑，11月份是亳州栽培知母最佳采收时间。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：197.

［2］梁雷，边宝林，王宏洁.不同产地知母药材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（16）：49－51.

［3］陈千良，王文全，马长华，等.西陵知母中芒果苷的含量动态研究［J］.中国中药杂志，2007，32（10）：971－972.

［4］容穗华，林海，高妮.不同产地知母有效成分含量的HPLC法测定［J］.现代医院，2011，11（6）：7－9.

［5］梁雷，边宝林，王宏洁.不同产地知母药材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（16）：49－51.

［6］陈千良，孙文基.知母药材和饮片含量测定修订研究［J］药物分析杂志，2010，30（11）：2075－2080.

Study on Best Harvesting Time for Rhizoma Anemarrhenae Cultivated in Bozhou

YU Nian－jun1，MA Yi－wen1，YU Jiao1，ZHENG Tai－hua2，LEI Xue－qiang2，CHEN Zi－hai2
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Anhui Key Laboratory of Modern Chinese Materia Medica，Anhui Hefei 230031，China；2.Anhui Haixin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Anhui Bozhou 236800，China）

Objective To determine the best harvesting time for Rhizoma Anemarrhenae cultivated in Bozhou，China.Methods High－performance liquid chromatography（HPLC）－ultraviolet spectrometry and HPLC－evaporative light－scattering detector（ELSD）were used to determine the content of mangiferin and timosaponin B－Ⅱin Rhizoma Anemarrhenae harvested at different times.For the determination of mangiferin，the mobile phase was acetonitrile－0.1％phosphoric acid（15∶85），with a flow rate of 0.8ml／min；the column temperature was 25℃；the detection wavelength was 317nm.For the determination of timosaponin B－Ⅱ，the mobile phase was acetonitrile－water（25∶75），with a flow rate of 1.0ml／min；the column temperature was 25℃；the drift tube temperature of ELSD was 60℃；the carrier gas pressure was 3.0N／cm2.Results The content of mangiferin and timosaponin B－Ⅱin Rhizoma Anemarrhenae harvested at different times was 1.10％－5.28％and 0.22％－8.68％，respectively.Conclusion The best harvesting time for Rhizoma Anemarrhenae cultivated in Bozhou is in November，when it has the highest content of mangiferin and timosaponin.

Rhizoma Anemarrhenae；high－performance liquid chromatography；mangiferin；timosaponin；harvesting time

R927.2

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.031

2013－07－15）

安徽省科技攻关计划项目（9010301014）

俞年军（1965－），男，副教授，硕士