丹参川芎有效成分配伍对缺氧损伤大鼠脑内皮细胞的影响

管敏国，张宇燕，万海同，周 鹏，杨 珍，杨洁红

（1.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学心脑血管病研究所，浙江杭州 310053）

丹参川芎有效成分配伍对缺氧损伤大鼠脑内皮细胞的影响

管敏国1，张宇燕2，万海同2，周 鹏2，杨 珍1，杨洁红1

（1.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学心脑血管病研究所，浙江杭州 310053）

目的 研究丹参川芎有效成分不同配伍对缺氧损伤大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的影响，并找出较优组合。方法 采用体外培养的rBMECs，并进行兔抗鼠Ⅷ因子鉴定，建立体外细胞缺氧模型。对参芎有效成分丹参素（A）、丹参酮Ⅱa（B）、川芎嗪（C）、藁本内酯（D）、阿魏酸（E），以3个剂量水平进行正交实验，另设正常组、模型组，观察不同配伍对细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、细胞上清液乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、细胞凋亡率及细胞周期的影响。采用正交方差分析、直观综合分析对实验结果进行多指标优化。结果 与模型组比较，各配伍样品均可提高SOD活性，降低LDH含量，减少细胞早期凋亡，抑制缺氧诱导的rBMECs发生G1／S期阻滞的作用。正交方差分析表明：A2B1C3D2E1为SOD的较优组合，A3B1C1D2E3为LDH的较优组合，A2B1C2D3E2为早期凋亡的较优组合，A2B3C3D3E2为G1期的较优组合，A2B3C3D2E2为S期的较优组合；综合分析结果显示A2B1C1D3E2为多指标的较优组合。结论 丹参川芎有效成分不同配伍可在一定程度上保护缺氧对rBMEC的损伤，不同配伍作用方式的侧重不同。

缺血性脑血管病；丹参；川芎；正交试验

缺血性脑血管病是指脑血管一时供血不足导致该供血区局灶性脑功能障碍，有较高的致残率和病死率，改善缺血半暗带区的血液供应是治疗关键。血管内皮细胞具有维持管壁通透性、抗凝、抗血栓形成、纤维溶解等广泛生理功能，它作为组织与血液间的第一道屏障，是最先感受缺氧的细胞之一［1］，血管内皮细胞损伤是脑缺血损害的早期病变和基本动因［2］，因此有效保护血管内皮细胞是预防和治疗心脑血管疾病的关键。

丹参、川芎属于活血化瘀药物，在临床治疗心脑血管疾病中往往配伍使用。以往对丹参、川芎的化学成分和药理活性已进行了较多的基础研究，发现其具有广泛的心脑血管方面活性［3－4］，但大都局限于单一成分研究。而中药成分复杂，其特点是多靶点、多渠道、多成分，往往不是一个有效成分，而是有效成分之间的相互协同、相加甚至拮抗的共同效应发挥疗效，因此中药应作为一个整体进行研究［5］。丹参主要有效部位为丹参水溶性和丹参脂溶性；川芎主要有效部位为川芎生物碱、川芎挥发油和川芎酚酸性。本实验从这5个主要有效部位中分别选取丹参素、丹参酮Ⅱa、川芎嗪、藁本内酯、阿魏酸5个有效成分，将这5个有效成分按正交试验方法组成配比不同的18个组合物，研究其不同配伍对缺氧损伤大鼠脑内皮细胞的影响，并进行多指标评价，选出较优配伍组合。

1 材料

1.1 动物 SD乳鼠10只，雌雄各半，1～3日龄，由浙江中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK（沪）2008－0016，上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供。

1.2 药品与试剂 丹参素钠：上海源叶生物科技有限公司，批号20120311；丹参酮Ⅱa、盐酸川芎嗪、阿魏酸：中国药品生物制品检定所，批号分别为110766－200619、110817－201006、110773－200611；藁本内酯：天津马克生物技术有限公司，批号20130420。丹参酮Ⅱa、藁本内酯分别用终浓度为0.04％、0.0025％的二甲基亚砜溶解（当二甲基亚砜≤0.1％时，不引起细胞生物学性状改变），4℃冷藏备用。M199培养基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青公司；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、D－Hank液、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记山羊抗兔IgG、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、双金鸡纳酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂：均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；FITC膜联蛋白Ⅴ（An－

nexinⅤ，AV）细胞凋亡检测试剂盒、PI／RNase staining缓冲液试剂盒：购自BD公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）：购自南京建成生物工程研究所；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器设备 3111型CO2培养箱：Thermo Scientific公司；SW－CJ－2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；LDZ5－2型低速自动平衡离心机：北京京立离心机有限公司；DMI4000B荧光倒置显微镜：德国徕卡公司；BD FACSCulibur流式细胞仪和Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪：美国BD公司；自制缺氧罐；Eppendorf移液枪。

2 方法

2.1 大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的培养 参考吴秀芹等［6］培养rBMECs的方法并加以改进。取10只1～3日龄SD乳鼠，颈椎脱臼处死，浸入75％乙醇中1～3min后，沿背正中线剪开头部皮肤，沿中线剪开颅骨并剥离，无菌取出大脑半球，立即放入含冷D－Hank液的培养皿里，用弯镊小心去除脑干、小脑、海马及大脑髓质并仔细剥离大脑皮质上软脑膜和大血管，用D－Hank液清洗2次后，将大脑皮质移入无菌的培养皿里，使用眼科剪将大脑皮质剪碎成1mm3大小的组织碎块，以上操作均在冰袋上进行。将剪碎的组织用0.25％胰蛋白酶（含乙二胺二乙酸钠）在37℃下消化20min，中途轻轻摇晃一次或不摇晃，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打均匀，依次通过80、200目不锈钢筛网滤过，收集200目上微血管段，离心（1 000r／min，10min），弃上清，在沉淀组织中加入适量0.1％Ⅱ型胶原酶，吹打均匀，37℃消化25min，10min摇晃1次，离心（1 000r／min，10min）。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种到细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱静置培养12h后第一次换液，以后每隔2d换液1次，7～9d细胞生长成致密单层，出现“铺路石”征象后进行传代培养，取2～3代细胞用于实验。用M199完全培养基将传至第3代的rBMECs接种至6孔板上，置37℃、5％CO2培养箱中培养，2d换液1次，待细胞基本融合铺满后用于实验。

2.2 rBMECs的鉴定 将细胞用37℃预热的PBS漂洗，加入95％乙醇固定5min，PBS洗3遍，吸干，加稀释10倍的兔抗鼠第Ⅷ因子抗体（阴性对照不加）和50μg／ml PI，以盖住细胞为宜，37℃反应30 min，用PBS洗去未结合的抗体，加羊抗兔IgG－FITC，37℃反应30min，用PBS洗去未结合的抗体，甘油封片，于倒置显微镜下观察。

2.3 正交实验设计 经甲基噻唑基四唑拒染试验确定各个药物的毒性剂量范围。将丹参素钠、丹参酮Ⅱa、盐酸川芎嗪、藁本内酯、阿魏酸的用药浓度和配伍比例按L18（37）正交实验进行分组，共分为18组，简称给药正交组。见表1、表2。

表1 L18（37）正交设计因素水平表

表2 参芎有效成分L18（37）正交设计因素水平表

2.4 分组、给药与模型复制 将基本融合铺满后的rBMECs分为正常组、模型组和给药正交组，每组3个复孔。实验前各孔吸去培养基，PBS洗1遍，正常组加入M199完全培养基1ml，模型组加入无血清M199培养基1ml，给药正交组加入含相应药物的无血清M199培养基1ml。正常组于37℃、5％ CO2培养箱中培养3h，其他各组放入密闭缺氧罐中，持续通入95％N2＋5％CO2的混合气体，5min后用封口膜密封缺氧罐接口，置于37℃恒温箱中继续培养3h。倒置显微镜下观察各组细胞形态。

2.5 检测指标

2.5.1 SOD活性和LDH含量检测：吸去各孔培养基，PBS洗2次，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，终止消化后离心收集细胞，在沉淀中加入1ml PBS，吹打均匀，再离心收集细胞沉淀，加入200μl PBS，吹打均匀，用超声将细胞裂解，按试剂盒说明书方法测定SOD活性。收集各孔细胞上清液20μl，按试剂盒说明书操作，测440nm处吸光度（absorbance，A）值，计算LDH含量。

2.5.2 流式细胞仪检测rBMECs早期凋亡及细胞

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD和Dunnet检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

周期：收集好细胞沉淀后，加AV结合缓冲液0.5 ml，吹打成细胞悬液，FITC AV／PI双染后，黑暗中反应30min，流式细胞仪检测凋亡。

收集好细胞沉淀后，以70％乙醇，－20℃固定一夜，PBS和Stain缓冲液分别清洗细胞1次，PI染色30min，上流式细胞仪检测细胞周期。

2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。呈正态分布的连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用LSD检验。正交试验数据采用一般线性模型的Univariate程序进行正交方差分析。

3 结果

3.1 rBMECs鉴定 对用Ⅷ因子及二抗处理的细胞进行扫描，可见细胞核出现黄色荧光，胞质出现绿色荧光，细胞核与细胞质之间具有明显的界限。而对照组只有细胞核显示黄色荧光，胞质不出现绿色荧光，细胞核与细胞质之间也没有明显的界限。结果表明所培养的细胞存在Ⅷ因子相关抗原，可认为是内皮细胞。见图1。

3.2 对缺氧损伤的rBMECs形态的影响 正常组rBMECs外观呈梭形，形态饱满，轮廓清晰，细胞核圆，核膜清晰，整体呈铺路石状。模型组大部分细胞由原本贴壁生长状态变为收缩变圆状态，且间隙变大，有出现凋亡及坏死细胞。给药正交组对rBMECs缺氧损伤显示出不同程度的保护作用。

图1 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定（10×20倍）

3.3 对缺氧损伤的rBMECs中SOD、LDH的影响 与正常组相比，模型组SOD活性显著降低，LDH释放显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，1、2、3、4、6、8、9、13、14组SOD活性显著升高（P＜0.05）；1、3、4、5、7、8、9、10、12、13、15、16、18组LDH释放显著降低（P＜0.05）。见表3。

3.4 对缺氧损伤的rBMECs早期凋亡的影响 与正常组比较，模型组rBMECs早期凋亡显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，1、2、4、5、6、7、9、10、11、13、14、17组细胞凋亡显著减少（P＜0.05）。见表3。

3.5 对缺氧损伤的rBMECs细胞周期的影响 与正常组相比，模型组G1期rBMECs显著增加（P＜0.05），S期和G2期rBMECs显著减少（P＜0.05）。与模型组相比，2、3、4、5、6、8、9、10、14、15组G1期细胞显著减少（P＜0.05）；2、3、4、5、6、8、9、14组S期细胞及2、3、4、5、8、9、14、15组G2期细胞显著增加（P＜0.05）。见表3。

表3 参芎有效成分配伍对缺氧损伤的rBMECs中SOD活性、LDH含量、细胞凋亡率及细胞周期的影响（±s，n＝3）

表3 参芎有效成分配伍对缺氧损伤的rBMECs中SOD活性、LDH含量、细胞凋亡率及细胞周期的影响（±s，n＝3）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，＊P＜0.05。

组别SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％细胞周期／％ G1期S期G2期正常45.57±1.57 67.93±4.60 10.71±1.23 72.46±1.14 20.12±0.91 7.42±1.10模型33.09±1.01△168.47±3.15△41.58±2.45△89.11±0.91△8.32±0.22△2.57±0.82△1 39.87±1.51＊86.80±4.01＊30.33±0.86＊88.55±1.01 8.33±1.08 3.12±1.12 2 42.63±1.16＊166.87±2.50 23.62±1.76＊83.82±1.20＊10.46±1.19＊5.72±0.99＊3 39.29±2.19＊161.23±3.62＊42.60±2.41 75.61±0.93＊17.23±0.98＊7.16±0.34＊4 38.94±1.85＊111.26±4.07＊27.52±0.93＊75.19±0.84＊19.12±0.36＊5.69±0.76＊5 31.16±1.87 151.87±3.88＊29.44±1.44＊79.56±1.23＊14.46±1.19＊5.98±1.25＊6 38.21±1.13＊171.27±3.73 38.64±0.64＊80.49±0.94＊17.58±1.47＊1.93±1.30 7 32.59±1.35 92.58±2.95＊32.38±0.87＊87.80±1.03 8.48±0.79 3.72±0.89 8 40.45±1.34＊158.33±3.43＊42.78±2.70 77.17±0.96＊16.57±1.25＊6.26±0.98＊9 38.98±1.79＊87.34±3.16＊26.53±1.51＊77.52±1.02＊14.51±1.28＊7.97±1.40＊10 34.49±0.77 131.50±2.84＊23.90±1.18＊86.75±1.09＊9.08±0.27 4.17±1.03 11 35.29±1.31 169.27±2.64 38.64±0.64＊88.34±0.74 8.28±0.37 3.38±0.89 12 32.81±1.53 97.40±3.17＊41.98±1.53 89.43±1.33 8.17±0.35 2.40±1.29 13 44.87±1.81＊131.83±3.27＊27.63±0.86＊88.16±0.84 9.63±0.86 2.21±0.67 14 37.24±1.12＊171.07±3.65 33.61±1.99＊81.57±1.48＊11.89±0.51＊6.54±1.67＊15 34.65±1.24 101.00±2.91＊40.37±1.42 83.34±1.09＊10.30±0.32 6.36±1.39＊16 34.51±1.49 102.70±2.91＊41.46±1.50 88.81±1.07 8.81±1.17 2.38±1.35 17 33.03±1.25 168.00±2.39 37.54±1.68＊89.14±1.02 8.50±1.13 2.36±1.37 18 32.55±1.42 162.20±3.25＊40.39±1.49 89.64±1.15 8.30±0.99 2.06±0.31

3.6 正交实验结果

3.6.1 正交方差分析：方差分析表明，因素E对SOD有显著影响（P＜0.05），其强弱顺序为E＞A＞D＞B＞C；因素B、C、D对LDH有显著影响（P＜0.05），其强弱顺序为B＞C＞D＞A＞E；因素A、B、C、D、E对早期凋亡都有显著影响（P＜0.05），其强弱顺序为E＞B＞D＞C＞A；因素A、C、D对G1期有显著影响（P＜0.05），其强弱顺序为C＞A＞D＞B＞E；因素A、C对S期有显著影响（P＜0.05），其强弱顺序为A＞C＞B＞D＞E。结果见表4。

表4 正交设计方差分析结果

3.6.2 正交直观分析：由表5可知，在SOD指标中，A2B1C3D2E1为SOD的较优组合；依次类推，A3B1C1D2E3为LDH的较优组合；A2B1C2D3E2为早期凋亡的较优组合；A2B3C3D3E2为G1期的较优组合；A2B3C3D2E2为S期的较优组合。

3.6.3 多指标较优组合分析：综合表4、表5分析，在较优组合中，因素A中水平2出现4次，水平3出现1次，出现水平3的在LDH指标中，而因素A对LDH无显著影响，故在最优组合选择中选A2；因素B中水平3对G1期、S期无显著影响，故选B1；因素C中水平3对SOD无显著影响，在早期凋亡中，水平1与水平2无显著差异，在G1期、S期中，水平1与水平3均无显著差异，故选C1；因素D中水平2对SOD、S期无显著影响，因指标凋亡比指标LDH重要，故选D3；因素E中水平1对SOD无显著影响，且因素E对LDH无显著影响，故选E2；综上所述，最终较优组合应为A2B1C1D3E2。

表5 正交设计直观分析结果（±s，n＝3）

表5 正交设计直观分析结果（±s，n＝3）

注：与水平1比较，△P＜0.05；与水平2比较，＃P＜0.05。

因素水平SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％细胞周期／％ G1期S期A 1 37.40 135.57 33.51 85.42 10.26 2 37.51 139.72 32.87 81.39△13.83△3 35.35 128.52 36.85△＃85.01＃10.86＃B 1 37.55 109.44 30.54 85.88 10.57 2 36.63 164.18△34.27△83.27 11.69 3 36.08 130.18△＃82.67△12.68 C 1 36.79 120.67 33.49 83.68 11.51 2 36.10 133.79 32.58 86.40 9.92 3 37.36 149.35△＃38.42△＃81.73＃13.53＃D 1 35.96 142.19 35.67 86.07 10.48 2 37.33 123.04△36.29 82.96 12.24 3 36.97 138.57＃31.27△＃37.17△＃82.79△12.23 E 1 38.21 135.66 36.48 85.49 11.46 2 37.47 138.37 29.26△82.42△12.23 3 34.58△83.91 11.26＃129.77 37.48＃

4 讨论

近年来，脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）在各种心脑血管病中的作用日益受到重视，它是血脑屏障的重要组成部分，在维持血脑屏障的完整、中枢神经系统内环境的稳定和保持正常脑血流中发挥重要作用［7］。

缺氧能促使BMECs产生大量的活性氧，而自由基、活性氧、脂质过氧化物等均可引起BMECs损伤［8］。LDH是细胞损伤的重要标志之一，当细胞缺血缺氧时，细胞膜结构受到破坏，通透性增加，细胞内有氧代谢减少、无氧代谢增加，使胞内LDH产生增加，其漏出也相应增加。缺氧使细胞内Ca2＋浓度的升高，进而活化Ca2＋、Mg2＋依赖性核酸内切酶，使核染色质DNA降解成单个或寡核苷酸小体，诱导细胞凋亡［9］，而内皮细胞对抗细胞凋亡是维持血管完整和新生血管重建的关键［1］。

参芎有效成分配伍能提高SOD的活性，降低LDH的量，减少细胞早期凋亡，抑制缺氧诱导的rBMECs发生G1／S期阻滞从而发挥保护作用。笔者也发现并不是每一组配伍对这些指标的影响都是一致的，往往同一个组对这个指标有明显保护作用，而对另一指标作用不明显，这可能因为各个药物作用的靶点不同，也可能因为药物间存在拮抗作用，这就要求研究者要进行合理的配伍以使药物的功效发挥最大化，这就得考虑每个药物的剂量和各个药物的配伍比例问题，要有中医“君臣佐使”的思想。经过多指标的综合分析，笔者找到一个较优配伍组合A2B1C1D3E2，即0.010mg／ml丹参素钠、0.000 5 mg／ml丹参酮Ⅱa、0.015mg／ml盐酸川芎嗪、0.010mg／ml藁本内酯、0.005mg／ml阿魏酸的配伍最优。该组合与第4组类似，只是藁本内酯由水平2变成了水平3，而第4组对每一个指标的作用

都是积极的，与模型组比较都有显著差异（P＜0.05），这也间接反映这个较优组合的可靠性，但还应做进一步验证。笔者认为在做这种组分配伍的实验研究中，结合中医的相关理论，也许会少走弯路，希望这种实验思路和方法对中药的标准化、客观化及配伍规律提供有益借鉴。

［1］吉瑞瑞，李付英，张雪静，等.淫羊藿苷对缺氧诱导血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（6）：525－530.

［2］罗玉敏，秦震.内皮细胞与脑缺血［J］.国外医学脑血管疾病分册，1998，6（5）：271－273.

［3］刘娟，刘颖.丹参药理活性成分研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12（7）：15－17.

［4］舒冰，周重建，马迎辉，等.中药川芎中有效成分的药理作用研究进展［J］.中国药理学通报，2006，22（9）：1043－1047.

［5］黄勇，齐晓岚，官志忠，等.灯盏细辛组分对脑神经细胞损伤保护作用的谱效关系研究［J］.中国中药杂志，2010，35（8）：1038－1041.

［6］吴秀芹，梅晓云，吴颢昕，等.大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：187－189.

［7］胡京红，司银楚，洪庆涛，等.天麻素对体外模拟脑缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用［J］.中华中医药杂志，2007，22（2）：124－126.

［8］林蓉，刘俊田，甘伟杰，等.川芎嗪对缺氧缺糖状态下培养的血管内皮细胞ECV－304的影响［J］.中国中药杂志，2004，29（5）：462－464.

［9］周鹏，周蕙芬，何昱，等.丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用［J］.中草药，2013，44（19）：2727－2731.

Effects of Different Doses of Active Ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on Rat Brain Microvascular Endothelial Cells during Hypoxic Injury

GUAN Min－guo1，ZHANG Yu－yan2，WAN Hai－tong2，ZHOU Peng2，YANG Zhen1，YANG Jie－hong2
（1.School of Basic Medical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China；2.Institute of Cardio－Cerebrovascular Disease，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China）

Objective To investigate the effects of different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on rat brain microvascular endothelial cells（rBMECs）during hypoxic injury and to determine the preferred dose combinations.Methods rBMECs were cultured in vitro and were identified with rabbit－anti－rat factorⅧantibody.The rBMECs were divided into normal group，model group，and test groups.An in vitro cell model of hypoxia was induced in the model group and test groups.The test groups were treated with different doses of tanshinol（A），tanshinoneⅡA（B），ligustrazine（C），ligustilide（D），and ferulic acid（E）.An orthogonal test was performed to investigate the effects of these active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong（each at three dose levels）on superoxide dismutase（SOD）activity in cells，lactate dehydrogenase（LDH）content in cell supernatant，cell apoptosis rate，and cell cycle.Orthogonal analysis of variance and direct comprehensive analysis were used to optimize the dose combination for these indices.Results Compared with the model group，the test groups had increased SOD activity，decreased LDH content，reduced early apoptosis，and inhibited G1／S arrest induced by hypoxia.The orthogonal analysis of variance showed that A2B1C3D2E1was the preferred dose combination for SOD，A3B1C1D2E3was the preferred dose combination for LDH，A2B1C2D3E2was the preferred dose combination for early apoptosis，A2B3C3D3E2was the preferred dose combination for G1phase，and A2B3C3D2E2was the preferred dose combination for S phase.The comprehensive analysis showed that A2B1C1D3E2was the preferred dose for multiple indices.Conclusion Different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong can reduce the hypoxic injury of rBMECs，and their action mechanism varies in different dose combinations.

ischemic cerebrovascular disease；Salvia miltiorrhiza；Rhizoma Ligustici Chuanxiong；orthogonal test

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.026

2013－12－19）

国家自然科学基金项目（81274176，81202636，81173647）；浙江省自然科学基金项目（LR12H27001）；浙江省中医药（中西医结合）重点学科（2012－XK－A06）

管敏国（1985－），男，硕士研究生

杨洁红，yjhong＠zxmu.edu.cn