肝豆灵对铜负荷肝纤维化大鼠肝星状细胞凋亡的影响

张 娟，谢道俊，韩 辉，沈 斌，鲍远程，童建兵，周 磊，杨 波，丁伟军

（1.安徽中医药大学第一附属医院神经内科，安徽合肥 230031；2.湖北中医药大学，湖北武汉 430065）

肝豆灵对铜负荷肝纤维化大鼠肝星状细胞凋亡的影响

张 娟1，谢道俊1，韩 辉1，沈 斌2，鲍远程1，童建兵1，周 磊1，杨 波1，丁伟军1

（1.安徽中医药大学第一附属医院神经内科，安徽合肥 230031；2.湖北中医药大学，湖北武汉 430065）

目的 观察肝豆灵对铜负荷肝纤维化大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）凋亡的影响，探讨肝豆灵防治Wilson病肝纤维化的作用机制。方法 将75只大鼠分成空白组、模型组、肝豆灵组、青霉胺组及肝豆灵＋青霉胺组，采用喂食硫酸铜饮食复制铜负荷大鼠模型，采用TUNEL法检测HSC的凋亡。结果 模型组可见大量HSC增生；与模型组比较，各治疗组HSC数量显著降低（P＜0.01），HSC凋亡指数显著升高（P＜0.01）；肝豆灵＋青霉胺组AI显著高于肝豆灵组和青霉胺组（P＜0.01）。讨论 肝豆灵可促进铜负荷大鼠HSC的凋亡，其与青霉胺联合用药的作用更显著。

肝豆状核变性；肝纤维化；铜负荷；肝星状细胞；肝豆灵；青霉胺

Wilson病（Wilson's disease，WD）作为铜代谢障碍性疾病，其发生肝脏病变的根本原因是肝细胞中ATP7B酶功能缺陷，不能将多余的铜离子从细胞内转运出去，造成游离铜在肝组织内缓慢蓄积。肝脏是铜代谢的中心器官，过度沉积的铜损害肝细胞，引起肝细胞变性坏死、炎性改变及肝纤维化，临床表现为活动性坏死后肝硬化或代偿性肝硬变。研究证实肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活是肝纤维化发生的主要环节，激活的HSC大量增殖，发生表型改变、分泌过多的细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）沉积于肝脏是肝纤维化形成的关键［1］。WD肝纤维化引起的肝功能衰竭通常是WD患者死亡的主要原因。因此，重视对WD肝纤维化的早期干预，对于改善WD患者的肝功能及预后都具有十分重要的意义。本实验采用肝豆灵治疗WD大鼠肝纤维化，旨在研究此方对HSC凋亡的影响，以探讨其治疗WD肝纤维化的作用机制。

1 材料

1.1 动物 实验用清洁级Wistar大鼠75只，雌雄各半，月龄均为3个月，平均体质量（200±20）g，购于南京医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2008－0004。动物房为普通级饲养室，实验前先适应性饲养1周。

1.2 主要仪器 切片机（Leica RM2135）：德国；切片漂烘仪（科力飞QP－B）：安徽合肥电子研究所；石蜡包埋机（亚光YB－7B）：湖北孝感；图像采集及图像分析系统：美国Bio－Rad生物仪器设备公司。

1.3 试剂和药物 二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）：北京中山生物技术公司；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）试剂盒：美国Roche公司；硫酸铜：天津巴斯夫化工公司；肝豆灵成药（院药制字Z20050071）：每片0.3g，安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供；阳性药物青霉胺（国药准字H31022286）：每片0.125g，上海信谊药厂有限公司生产。

2 方法

2.1 模型复制和分组 75只大鼠随机分为5组，每组15只，分别为空白对照组、模型对照组、肝豆灵组、肝豆灵加青霉胺组、青霉胺组。从实验第1天开始，除空白对照组予以普通饲料，其余4组均参照文献［2］复制铜负荷大鼠模型，即给予含硫酸铜1g／kg的饲料和0.185％硫酸铜的水，饲养12周。各组大鼠每天每只进食相等，并自由饮水。从第7周第1天开始各治疗组大鼠均予以相应药物灌胃。肝豆灵组大鼠按受肝豆灵0.486g／kg（相当于成人临床用量的6.3倍）灌胃，肝豆灵加青霉胺组大鼠接受肝豆灵0.486g／kg和青霉胺0.09g／kg（相当于成人临床用量的6.3倍）灌胃，青霉胺组大鼠仅接受青霉胺0.09g／kg灌胃，空白组和模型组大鼠接受等容量生理盐水灌胃。均每日1次，共6周。在第13周实验结束后，共死亡大鼠26只，剩余49只，各组动物禁食12h，在2％戊巴比妥钠腹腔麻醉下，分别留取血清、肝组织标本。

2.2 指标检测 采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果判定：胞质棕黄色的细胞为HSC，凋亡的HSC为胞质、胞核均呈棕黄色的梭型细胞。随机取5个

不同高倍视野观察，计数胞质为棕黄色的HSC的数量和胞质、胞核均呈棕黄色的梭型凋亡细胞的数量，并计算凋亡细胞百分比，取5个视野的平均数，得到凋亡指数（apoptosis index，AI）。AI＝凋亡细胞数／HSC数。

2.3 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计学分析。连续型变量用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。采用Kruskal－Wallis检验比较多组间HSC中位数，采用Mann－Whitney检验比较两组间HSC中位数；采用单因素方差分析比较5组间AI均数，采用Dunnett's T3检验比较两组间AI均数。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

空白组未见HSC表达，模型组可见大量HSC表达，各治疗组可见棕黄色、梭形、凋亡的HSC，增生的HSC数量较模型组明显减少。见图1。

与空白组比较，模型组HSC数量及AI显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组HSC数量显著降低（P＜0.01），AI显著增高（P＜0.01）；其中肝豆灵＋青霉胺组AI显著高于肝豆灵组和青霉胺组（P＜0.01）。见表1。

注：红色箭头示凋亡的HSC。图1 各组HSC细胞凋亡情况比较

4 讨论

肝脏是动物体内储存铜的重要器官，同时也是进行铜代谢的重要场所，WD患者自出生后铜就开始不断地在肝脏内蓄积，所以即使是青少年WD患者，其肝脏铜的积蓄量也往往超过正常人的10倍以上［3］。研究认为在WD的早期（无症状期），肝脏内已经出现线粒体明显形态异常。动物实验证实铜过载能诱发多种动物肝损害，当蓄积超过各种细胞器含铜蛋白质负载能力时，就会对细胞产生毒性，引起脂质过氧化、谷胱甘肽耗竭、线粒体损伤、溶酶体破裂，引起肝硬化。

表1 各组HSC数、AI比较（±s）

表1 各组HSC数、AI比较（±s）

注：a.中位数（四分位距）为101.50（29.72）；与空白组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与肝豆灵＋青霉胺组比较，△△P＜0.01。

组 别n HSC细胞数AI空 白8 4.37±1.85 0.03±0.02模 型10 96.00±22.95＊＊a0.21±0.10＊＊肝豆灵＋青霉胺11 76.18±16.31＃＃0.56±0.04＃＃肝豆灵10 57.80±10.76＃＃△△0.41±0.06＃＃△△青霉胺10 63.00±15.60＃＃0.43±0.05＃＃△△

蓄积的铜本身毒性很强，并且可作为氧化物前体促进自由基和有害的脂质及蛋白氧化物形成。铜通过氧自由基活化HSC，导致肝损伤修复时ECM的合成与降解不平衡，特别是后期ECM降解减少是导致WD发生肝纤维化或肝硬化的主要机制。HSC的激活和增殖是肝纤维化形成的中心环节，因而采用不同途径减少HSC的增殖并加速HSC的凋亡成为肝纤维化治疗的切入点。

中医学无肝纤维化病名，依据其肝硬化、腹水等表现，可属于“癥瘕”“瘀血”“积聚”“臌胀”等范畴。中医学认为先天不足、肝脾肾亏虚是引起本病的根本原因，情志失调、饮食不节、劳倦内伤等可诱发和加重本病。铜毒入里，脏腑功能失调致运化失常，蓄积体内，经过量变到质变，复感毒邪，外受内化而使铜毒加重。发病以青少年多见，多起病缓慢，逐渐加重。早期以气血亏虚、肝脾肾不足为主，临床期多以湿热蕴结、痰瘀阻络为主要表现。本病为本虚标实证，早期多虚，中后期多实，虚实夹杂。毒邪为害，铜毒、湿热、痰浊、瘀血为标，而变生诸症。现代医学已证实WD患者的铜中毒，主要是内在遗传缺陷，即先天禀赋不足，致机体阴阳失和，脏腑功能失调和气血运行不畅，导致胆汁不泌，铜毒不泄，蕴积体内而化生铜毒。WD肝纤维化因铜浊毒邪蓄积于肝，致肝之疏泄失常，胆汁排泄不畅，湿热铜毒内聚，外溢肌肤而为病，痰浊阻碍气机，血行不畅，痰浊与瘀血相结，则成“积聚”，毒邪日久不去，留着体内，则可损伤络脉。故WD肝纤维化的主要病机为铜毒内蕴、痰瘀阻络。

通腑利湿、化瘀散结的中药专方肝豆灵是针对以上病机研制的，该方由大黄、丹参、金钱草、黄连、姜黄、莪术等药物组成。肝豆灵注重标本同治，不仅以通腑利湿之法促进铜毒的排出，同时佐以化瘀散

结法以治“积聚”“癥瘕”。前期研究［4］发现肝豆灵可干预铜负荷大鼠肝纤维化的作用。

研究表明，大黄素通过多种途径发挥抗肝纤维化作用。体外实验显示大黄素可通过抑制蛋白酪氨酸激酶活性而发挥抑制HSC增殖的作用［5］。大黄素能浓度依赖地抑制细胞内胶原合成，降低胶原mRNA表达，促使ECM降解［6］。黄连具有抗氧化的作用，同时抑制胶原生成，促进病理沉积胶原的降解。黄连通过以上途径而发挥抑制HSC增殖和诱导HSC凋亡的作用。李欣等［7］研究发现，丹参素能明显抑制HSC的增殖活性和胶原表达，改善实验动物肝脏纤维化程度。赖文芳等［8］研究结果提示，丹参具有改善肝脏血液循环，抑制胶原生成，促进胶原降解，干预细胞内信号传导，抑制HSC活化的作用。丹参酸B能够通过抑制细胞外信号调节激酶磷酸化，抑制HSC的增殖及活化。郑元义等［9］研究结果提示，丹参素通过明显抑制HSC增殖而防治大鼠免疫性肝纤维化，抑制转化生长因子β、过氧化氢等诱导的HSC增殖，促其调亡。栾希英等［10］研究结果提示，三棱、莪术可降低肝纤维化大鼠白介素－1、白介素－6、肿瘤坏死因子－α的产生，抑制HSC的激活。李娟等［11］研究结果提示，三棱、莪术联用可调节细胞凋亡相关蛋白bax、bcl－2表达，而起到抗肝纤维化作用。何雅军等［12］研究结果提示，姜黄素可降低活化的HSC数量，增加HSC凋亡。

本研究表明，具有通腑利湿、化瘀散结作用的肝豆灵可促进HSC的凋亡，且以肝豆灵和青霉胺联合用药的效果为优，这可能是肝豆灵防治WD肝纤维化的作用机制之一。

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Effect of Gandouling on Apoptosis of Hepatic Stellate Cells in Copper－Overloaded Rats with Hepatic Fibrosis

ZHANG Juan1，XIE Dao－jun1，HAN Hui1，SHEN Bin2，BAO Yuan－cheng1，TONG Jian－bing1，ZHOU Lei1，YANG Bo1，DING Wei－jun1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430065，China）

Objective To observe the effect of Gandouling on the apoptosis of hepatic stellate cells（HSCs）in copper－overloaded rats with hepatic fibrosis and to investigate the action mechanism of Gandouling in the prevention and treatment of hepatic fibrosis in Wilson's disease.Methods Seventy－five rats were divided into blank group，model group，Gandouling group，penicillamine group，and Gandouling plus penicillamine group.All rats except those in blank group were given copper sulfate－containing feed to induce a copper－overloaded

Wilson's disease；hepatic fibrosis；copper overload；hepatic stellate cell；Gandouling；penicillamine

R575.2＋4

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.023

2013－07－07）

国家自然科学基金项目（81202692）；安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2012Z223）

张娟（1975－），女，博士，主治医师

rat model.The apoptosis of HSCs was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling.Results The model group had extensive proliferation of HSCs.Compared with the model group，all treatment groups had significantly reduced numbers of HSCs（P＜0.01）and significantly increased apoptotic indices（AIs）（P＜0.01）；the Gandouling plus penicillamine group had a significantly higher AI than the Gandouling group and penicillamine group（P＜0.01）.Conclusion Gandouling can promote the apoptosis of HSCs in copper－overloaded rats，and it has better efficacy when used in combination with penicillamine.