甘草甜素对缺血/再灌注损伤器官的保护机制及研究进展

曲德海(综述)，刘 冰(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院血管外科，哈尔滨 150001)

缺血/再灌注损伤是指缺血组织恢复血流使缺血性损伤加重的现象，是创伤、扩血管药物治疗、溶栓治疗、介入治疗、器官移植和休克复苏治疗后再损伤的重要病理基础，目前研究认为其发病机制主要涉及炎性反应、氧化应激损伤、钙超载、细胞凋亡等[1-2]。最近研究发现,高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)可在组织发生缺血/再灌注时主动或者被动释放至胞外，发挥一系列生物学效应，引起组织损伤[3]。研究发现，甘草甜素作为HMGB1抑制剂对缺血/再灌注器官具有保护作用[4-6]。

1 HMGB1的结构

HMGB1的氨基酸序列在不同物种间高度保守。HMGB1由215个氨基酸组成，相对分子质量约为30×103，其分子由2个带正电的同源DNA结合结构域(A框和B框)和1个带负电的富含谷氨酸及天冬氨酸的C端构成，B框与其在胞外作为炎性因子的生物活性有关[7-8]。

2 HMGB1的释放

当机体受到损伤或刺激时，HMGB1主要通过被动分泌及主动分泌两种途径由核内释放到胞外。这两者在分子机制、释放动力学、下游信号反应上是有区别的。被动释放由细胞完整性的破坏引发，发生速度快[9-10]。主动分泌，由胞外产物通过与细胞质膜受体相互作用引起一系列信号转导引发，发生速度较慢[11-12]。单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、内皮细胞等受微生物相关分子模式、病原相关分子模式和内源性炎性介质[包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、干扰素γ]刺激后可主动分泌HMGB1。HMGB1的主动分泌并不是通过经典的高尔基体-内质网途径进行，而是通过胞核-胞质-分泌性溶酶体-胞外途径进行，HMGB1通过这种非经典途径分泌是因为其缺乏引导肽结构[10]。研究表明，凋亡细胞也可释放相当数量的HMGB1，但其释放的HMGB1不能刺激巨噬细胞产生TNF，而坏死细胞被动释放的HMGB1具有显著的生物学活性。造成两者差异的原因是凋亡细胞中线粒体内的活性氧类氧化了HMGB1结构中B框第106位的半胱氨酸[13]。在这两条分泌途径中，HMGB1的分子结构是有区别的，即由炎性细胞主动分泌的HMGB1是高度乙酰化的，而坏死细胞被动释放的HMGB1则不是，目前尚不清楚这一区别反映在功能上的差异性。有研究表明，巨噬细胞及中性粒细胞在释放HMGB1之前还必须分别经过磷酸化和甲基化[14-15]。

3 HMGB1的受体及信号转导通路

HMGB1的主要受体包括晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)及Toll样受体(Toll-like recept,TLR)。

3.1RAGE及其信号转导通路 RAGE为跨膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，广泛表达于多种细胞表面，为多配体受体[16]，与HMGB1高度亲和，HMGB1通过与RAGE结合，激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)p38、核因子κB等信号通路，可以促进免疫细胞分化、成熟和迁移，并上调细胞表面的受体水平[17-18]。抑制HMGB1与RAGE的结合可阻断p44、p42、p38、Jun激酶、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、MAPK和核因子κB活化，影响HMGB1发挥胞外效应[19]。在小鼠肝缺血/再灌注损伤模型中，阻断HMGB1与RAGE结合可明显减轻肝损伤[20]。HMGB1在心肌缺血/再灌注损伤中可通过与RAGE结合，活化炎性通路，进而导致心肌损伤[21]。

3.2Toll样分子信号通路 TLR属于模式识别受体家族，目前TLR家族共有13个成员，与缺血/再灌注损伤密切相关的是TLR4、TLR9。其中TLR4是HMGB1介导的巨噬细胞活化，细胞因子释放、组织损伤的主要受体，也是目前关于HMGB1引起缺血/再灌注损伤研究中最关键的受体[22-23]。研究发现，TLR4基因敲除的巨噬细胞受到HMGB1刺激后不能产生TNF[24]。TLR4基因敲除小鼠肝缺血/再灌注损伤程度与野生型小鼠相比明显减轻[25]。HMGB1与TLR4在髓样分化蛋白2的帮助下相互结合，通过以下两条途径进行信号转导。

3.2.1髓样分化因子-依赖途径 HMGB1结合细胞表面的TLR4受体，活化髓样分化因子并激活其下游的信号分子，包括白细胞介素受体相关激酶1/2,MAPK p38、细胞外信号调节激酶1/2、JNK，核因子κB抑制蛋白激酶包括核因子κB抑制蛋白激酶α、核因子κB抑制蛋白激酶β等,激活核因子κB,促进相关基因转录及表达，产生一系列炎性因子。也有研究表明，CD24和Siglec-10能够协同抑制HMGB1-TLR4激活核因子κB[26]。

3.2.2髓样分化因子-非依赖途径 TLR与配体结合后，激活包括干扰素调节因子1、转录活化因子1/3等在内的下游信号分子，最终活化干扰素基因，引起干扰素α及干扰素β释放。

4 HMGB1的功能

4.1HMGB1的核内功能 核内HMGB1的主要功能是与DNA结合，稳定DNA结构，参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟等生命活动[27]。

4.2HMGB1的胞外功能及与缺血/再灌注损伤关系 Wang等[11]于1999年发现HMGB1可由细胞核内分泌到胞外，并作为一种必须的炎性因子参与炎症的发生与发展。近年研究表明，HMGB1在感染、自身免疫性疾病、呼吸失调、出血性休克、创伤、脑缺血损伤、动脉硬化、心肌梗死、肿瘤、缺血/再灌注损伤等病理过程中发挥重要作用[3]。与在脓毒症中扮演的“晚期炎性介质”的角色不同，HMGB1在心脏、肾、脊髓、肝脏缺血/再灌注损伤中扮演的角色却是“早期炎性介质”[21,28-30]。研究发现，心脏组织在缺血/再灌注损伤后HMGB1高表达，腹腔注射重组HMGB1后加重心脏组织的损伤，抗HMGB1抗体可以降低组织IL-6、TNF-α和细胞间黏附因子1的信使RNA水平，进而减轻再灌注损伤[21]。丙酮酸乙酯可以抑制HMGB1的释放，减轻脊髓、肾缺血/再灌注损伤[28-29]。顺铂能抑制HMGB1的移位和释放,减少TNF-α及IL-6的生成，减轻肝缺血/再灌注损伤[30]。使用HMGB1吸附柱，可以减轻小鼠肝缺血/再灌注损伤，显著改善小鼠生存率[31]。小鼠肾脏缺血/再灌注后肾组织HMGB1表达增强，应用抗HMGB1抗体损伤明显减轻[32]。大鼠小肠缺血/再灌注后小肠上皮细胞HMGB1表达增加，血清HMGB1水平于再灌注早期即可升高，再灌注3 h后达到峰值，抗HMGB1抗体处理后损伤减轻，48 h生存率显著提高[33]。

5 甘草甜素与缺血/再灌注损伤

甘草甜素是豆科植物甘草根部提取物的重要成分之一，含有2分子葡萄糖醛酸和1分子甘草次酸，具有水溶性[34]。研究证实，甘草甜素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、器官保护等作用。并且甘草甜素作为HMGB1抑制剂[35]，可以减轻器官缺血/再灌注损伤。

5.1甘草甜素与下肢缺血/再灌注损伤 Nakata等[4]在兔下肢缺血/再灌注损伤模型中发现，再灌注前及再灌注1 h后静脉注射甘草甜素可显著减轻下肢水肿程度、降低下肢肌肉坏死率、降低肌肉中髓过氧化物酶活性，表明甘草甜素可减轻下肢缺血/再灌注程度。

5.2甘草甜素与肠道缺血/再灌注损伤 Di Paola等[5]通过阻断肠系膜上动脉及腹腔干建立鼠肠道缺血/再灌注损伤模型发现，再灌注前5 min静脉注射甘草甜素可以降低平均动脉压下降程度、病死率、肠道组织髓过氧化物酶活性、肠道组织丙二醛水平、肠道组织核因子κB及转录活化因子3活性，减少细胞间黏附因子1表达、血浆中TNF-α及IL-1β水平，且在组织学上减轻肠道损伤。

5.3甘草甜素与肝脏缺血/再灌注损伤 Mabuchi等[6]在肝缺血/再灌注模型中于缺血前静脉给予大、小两种剂量(60 mg/kg,6 mg/kg)甘草甜素预处理，发现两者均可以显著降低血清丙氨酸氨基转移酶水平，大剂量给予甘草甜素预处理可以显著降低血清天冬氨酸转氨酶水平。不同剂量的甘草甜素预处理均可以明显改善再灌注期间肝内血流情况，大剂量的预处理可显著改善肝小叶灌注率。通过原位末端转移酶标记技术检查发现不同剂量预处理均可降低肝细胞凋亡率，降低肝组织中胱天蛋白酶3活性，大剂量预处理可明显降低血浆中HMGB1水平，通过组织学检查发现大剂量甘草甜素预处理对肝脏具有良好的保护功能。Oqiku等[36]发现，在阻断大鼠肝门前20 min给予甘草甜素(60 mg/kg，静脉推注)可以抑制库普弗细胞生成HMGB1，降低血浆HMGB1水平、肝组织中HMGB1表达及血浆天冬氨酸转氨酶水平，从而减轻肝脏再灌注损伤。

5.4甘草甜素与脊髓缺血/再灌注损伤 Gong等[37]在脊髓缺血/再灌注模型中于缺血前30 min静脉给予6 mg/kg甘草甜素预处理，发现血浆HMGB1水平随再灌注时间的延长而增加，于再灌注1 h后开始升高，再灌注24 h后达到峰值，并可长时间维持在较高水平。与损伤组相比，给予甘草甜素预处理可明显降低血浆HMGB1及炎性因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6)水平,并且发现两者的水平变化高度相关。甘草甜素预处理可以降低脊髓组织中HMGB1水平、减少坏死细胞数目，可以明显改善脊髓损伤后下肢神经功能。Ni等[38]的研究也支持以上结论，且发现再灌注组织中核因子κB、HMGB1及其受体RAGE、TLR4高表达，给予甘草甜素预处理可显著降低核因子κB、HMGB1表达，但对于受体RAGE、TLR4的表达没有明显影响，说明再灌注损伤后造成受体RAGE、TLR4的高表达的机制可能是多方面的。

5.5甘草甜素与心肌缺血/再灌注损伤 Zhai等[39]在鼠心脏缺血/再灌注模型中于再灌注前给予甘草甜素10 mg/kg预处理，发现甘草甜素预处理可以减少心肌梗死范围，降低血浆肌钙蛋白、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、HMGB1及炎性因子(TNF-α,IL-6)水平，并可通过抑制Bcl-2相关X蛋白转移、胱天蛋白酶3活性、细胞色素C的释放减少细胞凋亡。再灌注损伤后，JNK、MAPK p38及细胞外信号调节激酶1/2磷酸化水平均升高，说明给予甘草甜素预处理可以显著降低JNK磷酸化水平，但并不影响MAPK p38及细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化水平。

6 展 望

在动物缺血/再灌注损伤实验中，甘草甜素在抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等多方面对不同器官的缺血/再灌注损伤均表现出明显的保护作用。作为HMGB1抑制剂，甘草甜素可以抑制其炎性因子作用，显示出其在预防和治疗炎症相关疾病方面良好的应用前景。考虑到由于物种不同，对药物的吸收、代谢、分布、毒性反应也不同，应用于人体是否会发挥相同的作用还不清楚，所以甘草甜素能否用于临床预防及治疗缺血/再灌注损伤疾病还需要进一步的研究。

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