足细胞TRPC6与糖尿病肾病相关的研究进展

李 礼(综述)，王彩丽(审校)

(包头医学院，内蒙古 包头 014010)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，是导致终末期肾衰竭的重要原因，蛋白尿是DN最常见的临床表现之一，与DN的严重程度密切相关。蛋白尿的发生与肾小球滤过和肾小管的重吸收有关，但主要取决于肾小球滤过功能。肾小球滤过屏障由内皮细胞、血管基膜、脏层上皮细胞即足细胞组成。肾小球毛细血管内皮细胞为单层扁平细胞，厚约40 μm,主要限制带负电荷离子及血液中的有形成分滤出；血管基膜是胶原分子形成的均质薄膜；足细胞及足细胞足突连接形成的裂孔隔膜作为肾小球滤过的最后一道滤过屏障，对防止尿蛋白的漏出起着至关重要的作用。瞬时受体电位阳离子通道亚型6 (transient receptor potential channel 6，TRPC6)是新近发现的足细胞裂孔膜蛋白之一，与Nephrin、CD2AP、Podocin存在共定位分布，共同参与信号转导，并维持足细胞的功能，是近几年的研究热点。该文就足细胞TRPC6在糖尿病肾病中的发病机制及其应用进展予以综述。

1 TRPC6概述

TRPC是瞬时受体电位阳离子通道，它与TRPA、TRPV、TRPM、TRPP、TRPML共同组成一个瞬时受体电位超家族，在小鼠TRPC家族包括7个亚族：TRPC1～7，而在人类只有6个亚家族，其中TRPC2是一个伪基因。基于氨基酸序列的同源性和功能的相近性，TRPC通道分为3组：TRPC1；TRPC4、TRPC5；TRPC3、TRPC6、TRPC7。其中TRPC3、TRPC6、TRPC7在结构和功能上非常相近，有75%的同源性[1]，它们均被二酯酰甘油活化，同异质三聚体一起组成细胞表面有功能的离子通道。TRPC6是目前研究较多的一个亚型，与蛋白尿发生密切相关。人类TRPC6基因定位于常染色体11q21～22[2],共有132 287个碱基(GeneBank:NC000011)，含13个外显子。外显子1～13分别含有的碱基数(bp)为595，775，183，165，217，234，265，196，204，75，84，76，1465。其表达产物TRPC6蛋白编码931个氨基酸[2-3]。TRPC6是一个非选择性阳离子通道蛋白，具有拓扑结构，其N端和C端均在细胞内，被分为6个跨膜区，在第1和第2跨膜区的细胞外结构中有两个糖基化位点(Asn473、Asn561)，此结构对TRPC6的受体介导作用非常重要[3]，并且由第5和第6跨膜结构域共同构成发卡阳离子通道[4]。

TRPC6在脑组织、平滑肌、肾脏、免疫细胞和血细胞中均有表达[1]。2005年，Winn等[5]利用免疫荧光首次发现TRPC6在正常人肾小球和肾小管均有明显表达。Reiser等[6]通过激光共聚焦进一步证实，TRPC6广泛分布于肾小球和肾小管，而在肾小球中TRPC6蛋白主要表达于足细胞初级和次级足突，尤其在裂孔隔膜附近分布居多，肾小球内皮细胞仅见少量表达。Möller等[7]通过免疫荧光发现，TRPC6在正常人肾组织中遍布整个肾小球，尤其在毛细血管襻外周表达更强，是重要的足细胞裂孔膜蛋白之一。TRPC6可与Nephrin、Podocin、CD2AP等蛋白相互作用，共同组成足细胞裂孔膜复合体，调节足细胞的功能，维系正常肾小球滤过功能，它们的突变引起蛋白尿性肾小球疾病[6，8]。

2 TRPC6与Nephrin 、CD2AP的关系

Nephrin、CD2AP、Podocin等蛋白分子共同组成足细胞裂孔膜的重要分子，对维持裂孔膜的结构和功能起重要作用，而Nephrin分子又是维系裂孔隔膜功能的关键分子，其胞内段含有的部分酪氨酸残基可被酪氨酸激酶Fyn(Src激酶)磷酸化发挥信号转导作用，从而参与足细胞的细胞骨架重构等重要生理功能。Reiser等[6]应用免疫荧光双标记发现TRPC6与Nephrin、CD2AP存在共定位分布，免疫沉淀结果还提示TRPC6与Nephrin有相互作用，而与CD2AP无相互作用。Reiser等[6]还发现，Nephrin基因剔除的小鼠其足细胞内TRPC6表达增加而且分布发生了改变，呈颗粒样聚集，提示Nephrin缺失诱发了TRPC6表达的增加和分布的改变。反过来，TRPC6突变可干扰Nephrin-CD2AP-Podocin复合体的功能，导致足细胞功能的改变。近几年研究证实TRPC6与Nephrin可能参与共同的信号通路，Fyn激酶不仅可以磷酸化Nephrin从而启动Nephrin相关的信号通路[9]，也可以磷酸化TRPC6启动TRPC6信号通路[10]。说明TRPC6可与Nephrin共同组成裂孔膜上的信号复合体，维持足细胞的功能。

TRPC6与足细胞骨架蛋白关系密切，Reiser等[6]研究组发现TRPC6过表达的足细胞其肌动蛋白纤维丝缺乏。又有研究表明，体外培养的TRPC6蛋白过度表达时，肌动蛋白(actin)纤维大量解聚[7]。Jiang等[11]研究也发现，TRPC6过表达可引起纤丝状肌动蛋白分布紊乱和Nephrin及Synaptopodin表达下降，导致足突发生收缩和数量减少。Sun 等[12]通过构建针对TRPC6基因携带小发夹RNA(shRNA)真核表达载体，观察TRPC6基因剔除对嘌呤霉素诱导的足细胞损伤的影响，发现转染质粒的足细胞TRPC6 mRNA及蛋白的表达水平下降，α-肌动蛋白和微管蛋白的分布紊乱发生好转。这均提示TRPC6基因表达异常可引起足细胞结构的改变，从而引起蛋白尿。

3 TRPC6与信号转导

TRPC6在钙信号通路转导中发挥重要作用，调节Ca2+内流的机制主要有两种：①二酯酰甘油直接作用于TRPC6，二酯酰甘油依赖蛋白激酶C机制使细胞内Ca2+浓度升高，从而调节TRPC6通道的活性[13]，人胚肾细胞(HEK293)转染TRPC6后用二酯酰甘油的类似物OAG刺激发现Ca2+内流增加，TRPC6表达更多更持久[5]。Schlöndorff等[14]在人胚肾细胞株293T中转染了TRPC6突变体R895C,以转染野生型的TRPC6的293T细胞做对照，经钙成像分析发现，其胞内Ca2+浓度显著高于对照组细胞，TRPC6蛋白的表达也显著高于对照组，随后发现转染了TRPC6突变体的足细胞明显受损。②依赖磷脂酶C信号通路,磷脂酶C的抑制剂U73122可使TRPC6通道开放减少[15]，并使依赖于细胞内Ca2+浓度变化的肌动蛋白细胞骨架纤丝状肌动蛋白的紊乱分布得以恢复。又有研究证实，血管紧张素Ⅱ可诱导足细胞凋亡，其机制与Ca2+内流导致细胞内Ca2+浓度升高有关，故临床试验发现用血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂可减缓肾脏病的进展，特别对于糖尿病肾病患者[16]。其机制可能与减少足细胞凋亡有关。TRPC6过表达可以激活Ca2+依赖的RhoA信号通路，从而引起足细胞上的骨架重排。Jiang等[11]研究发现，TRPC6过表达可引起Ca2+内流增加，RhoA酶活化，在给予RhoA抑制剂后，错误分布的纤丝状肌动蛋白及表达下调的Nephrin及Synaptopodin均得以恢复。由此看来，TRPC6信号通路相当复杂，还需大量的研究证明。

4 TRPC6与蛋白尿

2005年，Winn等[5]首次报道TRPC6位于肾小球足细胞，其基因突变可导致大量蛋白尿，引起局灶性节段性肾小球硬化和进行性肾衰竭。Reiser等[6]研究发现，在人类获得性蛋白尿性疾病，如局灶性节段性肾小球硬化、微小病变肾病、膜性肾病及嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型TRPC6过表达，在体外培养的经补体刺激模拟膜性肾病足细胞损伤的足细胞中也有过度表达。Reiser等[6]还发现，用TRPC6高表达质粒转染小鼠后可导致蛋白尿的发生。Yu等[17]构建嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型发现，随着TRPC6表达的显著增加，足细胞的损伤达到了峰值，蛋白尿逐渐加重，然后将大鼠的足细胞体外培养，使用TRPC6抑制剂地塞米松处理足细胞，结果发现TRPC6表达明显减少，且对足细胞有一定的修复作用。在国内也有研究，李大勇等[18]用免疫组织化学及免疫荧光共聚焦显微镜下观察TRPC6的表达与分布，发现TRPC6在膜性肾病组表达增加且分布发生改变，呈点状、团块状不均匀分布。说明无论是先天的还是后天获得性肾病蛋白尿的产生均与TRPC6基因突变或表达改变有关。

5 TRPC6与糖尿病肾病

足细胞足突内可能存在一个收缩蛋白装置，足细胞骨架蛋白，如α辅肌动蛋白和微丝结合蛋白Synaptopodin的编码基因异常可引起足突融合、消失以及裂孔隔膜结构的破坏。足突内的细胞骨架成分主要为微丝，又称纤丝状肌动蛋白,是最主要的足突骨架结构蛋白，微丝结合蛋白α辅肌动蛋白和Synaptopodin可影响纤丝状肌动蛋白的聚集和解聚，从而影响足细胞的结构和功能改变。有研究提示，TRPC6可能是足细胞感受机械压力变化的感受器，将胞外的刺激通过G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶的途径传入胞内并转换为Ca2+相关信号，进而调控足细胞骨架的排列。DN时足细胞骨架紊乱和足突消失[11]。有研究发现2型糖尿病患者有微量蛋白尿时就有足细胞数量的明显减少，进一步研究发现足细胞数量的减少与糖尿病肾病的发生、发展成同步平行性[19]。刘志红等[20]对2型糖尿病患者研究表明，随着足细胞数量的减少，糖尿病肾病患者的病情加重。Dalla Vestra等[21]通过对67例白人2型糖尿病患者肾活检研究发现，2型糖尿病患者的足细胞数量明显低于对照组，且白蛋白排泄率与足细胞的数量呈反比。大量的实验和临床资料表明，足细胞数量对肾小球硬化的发展起着决定性作用[22]。但TRPC6引起糖尿病肾病蛋白尿的机制相当复杂，需要不断的研究进一步阐明和发现。

6 结语和展望

事实上，DN蛋白尿的发生机制相当复杂，往往是多个因素综合作用的结果。TRPC6为新近发现的重要的足细胞膜蛋白，并且维系足细胞的正常生物学功能。TRPC6基因突变在临床上引起蛋白尿的发生，使肾小球硬化，进一步引起终末期肾衰竭。然而，有关TRPC6在肾脏疾病的作用、参与获得性和实验性蛋白尿发生、发展中的确切机制、与足细胞结构蛋白间的确切关系等诸多问题尚有待进一步阐明。而且，由于足细胞在肾脏疾病中的重要作用，足细胞及其相关分子已成近年研究的热点，如何阻止并且避免足细胞发生损伤，仍具有重要意义。

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