支气管哮喘动物模型建立及研究现状

陈一平(综述)，李超乾(审校)

(广西医科大学第一附属医院呼吸内科,南宁 530021)

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。近年来随着生活方式改变及环境因素的影响，特别是在发达国家，哮喘发病、防治成本及疾病负担有逐年增高的趋势，据WHO最新报告，目前约有2.35亿人受哮喘疾病影响[1]，因此哮喘的相关研究越来越受到医学界的重视和关注。哮喘发病机制复杂，鉴于人体试验的局限性，有关哮喘发病机制的探索、新治疗方法的评价、新药研究与开发都主要依赖于动物实验。随着动物模型研究的进步和基因敲除及转基因等技术的出现，使模型动物的选择和动物模型的建立方法逐步改进以达到尽可能模拟人类哮喘疾病过程的目的，下面就支气管哮喘的动物模型的建立进展进行综述。

1 小 鼠

其免疫遗传背景清楚，品系纯，来源广，相关生物学试剂及抗体易获得。可复制产生与人类相似的气道高反应、气道慢性炎症、黏液增多等症状,并已有反应气道慢性炎症过程的气道重构模型,虽然有体积小、操作及取材较困难，制作往往需要多次致敏和激发等缺点，目前仍为支气管哮喘研究最为常用的动物模型。常用的小鼠品系为BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前两种品系最常用。

1.1BALB/c小鼠 起源于小家鼠Mus musculus，1920年在纽约诞生，至今在全球研究机构繁衍了超过200代，广泛用于免疫学、生理学的动物实验，也是目前研究支气管哮喘的主要实验动物。实验中常常选用6～8周龄，体质量18～22 g的雌性小鼠。对于不同种类的哮喘模型，在制备方法上也有所差异，下面就以BALB/c小鼠为重点，分别阐述各类哮喘模型的建立进展。

1.1.1变态反应性哮喘

1.1.1.1卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱发的支气管哮喘模型 卵清蛋白因其免疫原性强、获得方便，价格便宜成为目前研究最多、应用最广、技术也最成熟的诱喘剂，并常与佐剂合用建模，常用佐剂有氢氧化铝、明矾、百日咳杆菌、抗酸杆菌、内毒素等。目前最常用的造模方法是：第0天、第14天腹腔或皮下注射OVA致敏液0.2 mL/只(含OVA 100 μg)致敏，第21天开始连续雾化吸入5%OVA激发，1次/d，30 min/次，连续雾化7 d以诱发哮喘。目前，在OVA的应用剂量上湛孝东等[2]实验表明低浓度(10 mg/L)的OVA连续致敏小鼠造成过敏性哮喘病理改变较为明显，高浓度(1000 mg/L)会导致模型免疫耐受。在激发方法上沈璐等[3]发现滴鼻激发建立的哮喘模型气道炎症及气道反应性升高更为显著。在气道炎症和气道高反应性的研究上，谢佳星[4]发现平均中位直径2.9 μm的雾化颗粒激发的小鼠的气道反应性明显高于平均中位直径8.6 μm的雾化颗粒激发的小鼠，但在气道炎症表现上无明显差异，提示建立哮喘模型时注意变应原的大小，并可以利用变应原大小的不同建立具有明显的嗜酸性粒细胞气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠模型。

1.1.1.2花粉诱发的支气管哮喘模型 季节性哮喘的诱因中花粉和真菌占很大比例，建立此类模型对研究变应性哮喘有很大意义。李雅莉等[5]应用葎草花粉粗浸液致敏激发的BALB/c小鼠建模，具体方法为：腹腔注射300 μg葎草花粉粗浸液加氢氧化铝凝胶2 mg致敏，之后第7、14天后加强致敏，方法与剂量同上。第24天给予30μL(10 g/L)葎草花粉粗浸液滴鼻激发，每日1次，连续5次激发。王胜昱等[6]研究了在100、200、300 μg剂量下藜草花粉粗制变应原腹腔致敏与滴鼻激发诱导的小鼠变态反应气管炎症动物模型，发现剂量越高，症状及实验室指标越明显，病死率也越高。

1.1.1.3有机粉尘诱发的支气管哮喘模型 有机粉尘种类众多，应用于诱发的支气管哮喘模型研究较多的是屋尘螨及蟑螂。最近国外相关屋尘螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻内滴入屋尘螨3～6周[7-8]，朱艳芬等[9]研究了不同浓度致敏激发下小鼠支气管哮喘气道重构模型存在明显剂量效应关系及时效关系，结果显示高浓度屋尘螨提取物9周时气道重构表现最为明显。

1.1.2感染性哮喘 采用比较多的是呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virues，RSV),内毒素脂多糖等。蒋雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激发的哮喘小鼠呼吸道炎症明显加重，呼吸道反应性显著增加，且气道高反应性持续时间明显延长。张雷英等[11]研究了感染时期对哮喘模型的影响，致敏前感染RSV明显抑制OVA诱导的肺炎症，RSV/OVA组小鼠肺组织内炎性细胞浸润显著减轻，但致敏后感染RSV则对OVA诱发的气道变态炎症无明显影响。Newcomb等[12]则发现IL-17A基因敲除的小鼠比野生小鼠在经OVA及RSV致敏激发的过程中表现出了更强烈的气道高反应性和气道炎症症状。

1.1.3职业性哮喘 此类哮喘多为工作人员在生产环境中反复接触有机酸酐所致，随着全球工业化进程的加快，逐步得到国际上中、美、英、德、日等国家重视。职业性哮喘的动物模型多以小分子半抗原致敏。这组化合物包括邻苯二甲酸酐、偏苯三酸酐(trimellitic anhydride，TMA)、六氢邻苯二甲酸酐等，模型建立主要以大鼠及豚鼠为主。甲醛近年来在室内污染研究中越来越受到重视，刘丹丹[13]发现虽然单独的气态甲醛致敏激发小鼠只能产生呼吸道嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)比率增加，不能诱发典型哮喘症状，但可以以类似佐剂的作用加重哮喘小鼠模型症状。

1.2C57BL/6小鼠 源于艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株,1921年诞生，1985年引入中国。实验小鼠多选用鼠龄4～8周，体质量在18～22 g之间，性别选择要求不严，但为避免雄性小鼠为争夺交配权而造成实验动物的浪费，多数研究还是选择雌性小鼠。国内黄华琼等[14]分别研究了5周龄开始致敏9周龄激发、5周龄开始致敏49周龄激发、45龄致敏49周龄激发的3组C57BL/6小鼠,发现早期致敏有利于哮喘模型的建立，致敏和激发的时间可影响炎症的严重程度。同时，早致敏晚激发的方法可获得稳定的EOS炎症、黏液高分泌和气道高反应的变化。Bogaert等[15]应用OVA及弗氏佐剂致敏建立了长久以来被忽视或误解的中性粒细胞性哮喘小鼠模型。Corry等[16]在1996年就曾经在研究中应用OVA采取皮内注射致敏、雾化吸入激发的方式成功建立了C57BL_6小鼠的哮喘模型，并发现了C57BL_6小鼠在气道反应性变化上不如balb_c小鼠。因此目前C57BL_6小鼠哮喘模型的应用远比不上balb_c小鼠，少数应用OVA建立C57BL_6小鼠哮喘模型的研究方法都与balb_c小鼠类似，这里不再赘述。

由于C57BL_6小鼠对尘螨和豚草抗原反应性较强，故在有机粉尘诱发的哮喘模型研究中应用较多。常用造模方法：在实验第1天腹腔加皮下注射致敏剂50μL/只，第7天腹腔注射致敏剂50 μL。于第15～18天，用尘螨粗提浸液50μL/d，一次性缓慢滴鼻激发。在致敏方式的研究上，孔存权等[17]比较不同致敏方式在相同激发下的结果，发现尘螨粗提浸液可以单独应用建立哮喘模型，但就稳定性和成功率而言，加用佐剂或OVA更好。陈华夏[18]应用了基因敲除技术建立模型动物，发现CXCR34基因敲除小鼠经粉尘螨提取液致敏并激发的哮喘模型较野生C57BL_6小鼠模型肺部炎症应答更加严重。

2 大 鼠

大鼠品系纯，来源广，价格较便宜，有关分子生物学试剂较多，标本采集量较充足，对抗原反应性较为一致，能出现与人类哮喘类似的速发相及迟发相变态反应，用大鼠制作哮喘动物模型的技术也较成熟，大鼠基因组与人的基因组序列较为相似，大鼠体内很多酶存在基因互补的抗体及探针，可以使对这些酶进行的量化及定位研究更为直接，因而大鼠哮喘模型应用也较多，国内以Wistar大鼠、SD(Sprague Dawly)大鼠，BN(BrownNorway)大鼠为主。

2.1Wistar大鼠 1907年由美国wistar研究所育成。多选择鼠龄6～8周，体质量(200±50) g，常用造模方法为：即第1天及第7天将单只大鼠腹腔注射1% OVA 1 mg(含l%氢氧化铝凝胶及6×106/L百日咳灭活菌苗混合液1 mL)致敏，第15天开始雾化吸入2%OVA，连续7 d。鲁燕霞[19]观察了幼年(断奶21 d)大鼠给予连续7 d束缚应激及成年(9周)大鼠给予连续21 d束缚应激后常规造模，提示心理应激能加重Wistar大鼠哮喘模型气道炎症表现。乔永康[20]研究了甲醛(formaldehyde，FA)在大鼠哮喘模型中的作用，结果表明0.5 mg/m3和3.0 mg/m3的气态FA暴露易化或恶化OVA诱导型哮喘。对于单独应用3.0 mg/m3FA组，一方面该组FA暴露可诱发实验大鼠持续的气道高反应性，另一方面高浓度FA单独暴露可能通过激活Th1类免疫反应和非EOS炎症而诱发气道高反应性等哮喘样症状。

2.2SD大鼠 1925年，美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)农场用Wistar大鼠培育而成。实验模型多选雄性SD大鼠，鼠龄6～8周，体质量(200±20) g，常用造模方法为：大鼠则行OVA腹腔内注射给药，每隔7天1次，从第16天开始大鼠进行雾化吸入1% OVA，每次雾化30 min,共连续10 d吸入；张婷[21]在腹腔注射OVA致敏后以滴鼻和雾化的方法分别建立上下气道炎性反应。龚萍等[22]对比了不同方式哮喘激发发现，泵雾化激发方式优于传统的超声雾化激发方式。SD大鼠是研究职业性哮喘的常用模型动物，冯里[23]改进了以往的造模方法：d1致敏：在大鼠背部两侧分4点皮内注射0.15 mL含50%TMA的AOO(丙酮∶橄榄油=4∶1，体积比)溶液；d8致敏：两耳背各皮下注射0.075 mL含25%TMA的AOO溶液；后6周每周1次雾化含TMA 60 mg的雾化液激发15 min，成功建立哮喘模型。同时对比研究了邻苯二甲酸酐引发哮喘的比例不及TMA。

2.3BN大鼠 1930年Wistar研究所的King在野外捕获的野生大鼠，并由King和Aptekman维持繁育，其中一个大鼠品系发生褐色突变，1958年Silvers和Billingham利用它们进行兄妹交配并进行组织相容性选择后获得。相较于前两种品系的大鼠，BN大鼠应用相对较少。实验模型多选SPF级雄性SD大鼠，体质量200 g左右，目前常用为：d1皮下注射含OVA 100 μg、5×108个灭活百日咳杆菌疫苗和氢氧化铝凝胶的生理盐水混悬液1 mL，14 d后以5%的OVA生理盐水溶液5 L/min雾化吸入5 min，激发哮喘发作，连续3次，每次间隔5 d[24]。

3 豚 鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最经典的动物哮喘模型，在1976年就有应用OAV建立豚鼠哮喘模型的报道[25]，后来随着研究的深入文献报道很多，Ressmeyer等[26]也认为豚鼠在气道药理模型上比大鼠及小鼠更合适。因为用于豚鼠的检测试剂不多，尤其是抗体部分，这就限制了研究工作的开展。而且豚鼠敏感性强，个体反应差异大，对于致敏原不反应或明显反应甚至死亡，影响造模成功率，且实验动物相对于小鼠和大鼠而言较为昂贵，会导致研究成本的增加，故近年来豚鼠用于支气管哮喘建模有逐步减少的趋势。试验豚鼠多数研究选择雄性豚鼠，鼠龄25～35 d，体质量(200±50) g，造模方法一般为：实验第1天腹腔注射10%的OVA1 mL，2周后把豚鼠置于密闭的玻璃雾化罩内以l%的OVA雾化诱喘，每日1次直至哮喘典型症状出现。李海银等[27]应用OVA联合弗氏佐剂致敏豚鼠建立了中性粒细胞哮喘的豚鼠模型。

4 其他哮喘模型动物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外还有一些相对大型的动物可以选择，例如猫可发生类似于人类慢性哮喘的支气管疾病；马可以形成以中性粒细胞升高为主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特点，可能与慢性阻塞性肺疾病的联系更加密切；已知羊和犬对某些变应原天生就敏感[28]，猴的免疫系统和人非常相似，但是存在动物来源及实验成本的限制，研究与应用都相对较少。

5 结 语

虽然目前支气管哮喘的动物模型可选的实验动物越来越多，针对不同诱因的哮喘建立模型的方法越来越完善，建立的动物模型都出现了典型行为学表现，肺病理切片中的各种细胞、BALF中细胞计数、分类、EOS比率及相关生理功能指标等都符合哮喘的疾病特征，但目前仍没有哪种模型可以完全模拟人类哮喘的疾病过程，所以为了弄清楚哮喘的发病机制并最终能更好的预防和治疗支气管哮喘，仍需在实验动物模型的建立上更加努力。

[1] Seo JW,Cho SC,Park SJ,etal.1′-Acetoxychavicol Acetate Isolated from Alpinia galanga Ameliorates Ovalbumin-Induced Asthma in Mice[J].PLoS One,2013,8(2):e56447.

[2] 湛孝东，姜玉新，李良怿，等.不同浓度卵蛋白变应原对小鼠哮喘模型建立的影响[J].中国实验动物学报,2012,20(4):16-20.

[3] 沈璐，赖克方，姜华，等.不同激发方式对小鼠过敏性支气管哮喘模型的影响[J].国际呼吸杂志,2009,29(15):909-913.

[4] 谢佳星.呼吸道高反应性发生条件及机制的探讨[D].广州：广州医学院,2009.

[5] 李雅莉，张明，卢家美，等.葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立[J].西安交通大学学报：医学版,2010,31(5):562-565.

[6] 王胜昱，孙秀珍，卢家美，等.藜草花粉特异性致敏哮喘动物模型的制备[J].陕西医学杂志,2010,39(9):1113-1116.

[7] Fredriksson K,Fielhaber J A,Lam J K,etal.Paradoxical effects of rapamycin on experimental house dust mite-induced asthma[J].PLoS One,2012,7(5):e33984.

[8] Ward MD,Chung YJ,Copeland LB,etal.Allergic responses induced by a fungal biopesticide metarhizium anisopliae and house dust mite are compared in a mouse model[J].J Toxicol,2011,2011:360805.

[9] 朱艳芬，宋泽庆，林璘.支气管哮喘小鼠呼吸道重构模型的构建及评价[J].吉林大学学报：医学版,2010,36(1):99-103.

[10] 蒋雄斌，殷凯生，朱毅.呼吸道合胞病毒感染对卵白蛋白诱导的哮喘小鼠呼吸道高反应动态变化的影响[C]//中华医学会第六次全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第二次大会.中华医学会第六次全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第二次大会论文汇编.苏州:中华医学会呼吸病学分会,2008:88-94.

[11] 张雷英，吴建奇，刘静，等.γδ T细胞参与呼吸道合胞病毒感染对呼吸道变态炎性反应的影响作用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2012,32(3):234-238.

[12] Newcomb DC,Boswell MG,Reiss S,etal.IL-17A inhibits airway reactivity induced by respiratory syncytial virus infection during allergic airway inflammation[J].Thorax,2013,68(8):717-723.

[13] 刘丹丹.气态甲醛暴露对卵清蛋白免疫的Balb/c小鼠哮喘发生的影响[D].武汉：华中师范大学,2010.

[14] 黄华琼，王娇莉，叶飒，等.不同致敏和激发时间对哮喘模型的影响[J].中国病理生理杂志,2008,24(11):2285-2288.

[15] Bogaert P,Naessens T,De Koker S,etal.Inflammatory signatures for eosinophilic vs.neutrophilic allergic pulmonary inflammation reveal critical regulatory checkpoints[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2011,300(5):L679-L690.

[16] Corry DB,Folkesson HG,Warnock ML,etal.Interleukin 4,but not interleukin 5 or eosinophils,is required in a murine model of acute airway hyperreactivity[J].J Exp Med,1996,183(1):109-117.

[17] 孔存权，彭霞，白萍，等.尘螨粗提浸液致敏小鼠的方法学研究[J].国际检验医学杂志,2010,31(6):528-530.

[18] 陈华夏.粉尘螨提取液致敏CXCR3基因剔除小鼠肺部变应性炎症的研究[D].北京：北京协和医学院 清华大学医学部,2009.

[19] 鲁燕霞.幼年心理应激对支气管哮喘大鼠中枢与外周免疫功能的影响[D].济南 山东大学,2010.

[20] 乔永康.甲醛诱导型哮喘大鼠模型的建立及其机理研究[D].武汉:华中师范大学,2008.

[21] 张婷.树突状细胞与上下呼吸道炎性反应一致性研究[D].泸州:泸州医学院,2012.

[22] 龚萍.大鼠哮喘模型的改良与评价[D].长沙:中南大学,2009.

[23] 冯里.三拗汤及类方对TMA致哮喘模型大鼠作用、作用机理及物质基础研究[D].南京:南京中医药大学,2009.

[24] Venkatesan N,Siddiqui S,Jo T,etal.Allergen-induced airway remodeling in brown norway rats:structural and metabolic changes in glycosaminoglycans[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2012,46(1):96-105.

[25] Muller E,Bergmann KC,Lachmann B,etal[Experimental model of bronchial asthma (author′s transl)][J].Z Erkr Atmungsorgane,1976,144(3):246-253.

[26] Ressmeyer AR,Larsson AK,Vollmer E,etal.Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices:comparison with human tissues[J].Eur Respir J,2006,28(3):603-611.

[27] 李海银，朱黎明，戴爱国，等.豚鼠中性粒细胞性哮喘模型的建立[J/CD].中华哮喘杂志：电子版,2012,06(4):245-249.

[28] Padrid P.Chronic lower airway disease in the dog and cat[J].Probl Vet Med,1992,4(2):320-344.