稳定表达绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2蛋白细胞系的建立

刘 畅，李 磊，于立新，么宏强，周建华，马学恩*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001)

绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis，OPA)是由绵羊肺腺瘤反转录病毒(Jaagsiekte retrovirus，JSRV)引起的一种慢性、进行性及接触传染性的肺脏肿瘤性疾病。JSRV 受体为透明质酸酶-2(hyaluronoglucosaminidase 2，Hyal-2)[1]，是JSRV 进入细胞时所需的受体，当JSRV 感染肺上皮细胞时，与其受体相结合，JSRV 会在肺上皮细胞内高度增殖，可以引发OPA 的发生。Hyal-2 是一种糖基磷脂酰肌醇键(GPI)锚定蛋白，其以锚定形式存在于细胞表面，并且在培养的细胞中表现出较低透明质酸酶活性。其不仅局限于肺上皮细胞膜上，也存在于多种细胞的质膜上[1-2]，因此Hyal-2 受体并不是JSRV感染的唯一决定性因素[2-4]。有研究表明，Hyal-2 不仅可以作为JSRV 及地方鼻肿瘤病毒的受体，而且还是内源性JSRV 的受体[5]。NIH 3T3 小鼠成纤维细胞具有强烈的接触抑制作用，所以能够明确地识别已发生转化的细胞，可以应用于JSRV 致瘤机制的研究。

本研究通过构建含有绵羊Hyal-2 基因的真核重组表达质粒pcDNA-Hyal2-HA，转染NIH 3T3 细胞，建立了稳定表达Hyal-2 的NIH 3T3 细胞系，为进一步研究JSRV 与其受体的相互作用机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 NIH 3T3 细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；含有JSRV env 基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-env 由本实验室构建并保存。pcDNA3.1(+)真核表达载体购自Invitrogen 公司；E.coli DH5α 感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要试剂和工具酶 Hin d Ⅲ、XbaⅠ、pMD18-T、T4 DNA Ligase、SYBR®Premix Ex TaqTM、CellAmp®Direct RNA Prep Kit for Real-time RT-PCR 等购自TaKaRa 公司；PmlⅠ购自NEB 公司；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司；G418 购自Gibco 公司；抗血细胞凝集素(HA)单克隆抗体(MAb)购自Cell Signaling 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)、山羊抗小鼠IgGFITC、超敏发光试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；cDNA 合成试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收纯化试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计 根据GenBank 中登录的绵羊Hyal-2 mRNA 序列(NM_001009754)设计两对引物，将其分为互相重叠的两段。前一段引物为QHyal2-F：5'-CAAATGACACTGACTTCCTGCAG-3'和QHyal2-R：5'-GAACTCAAACTCATACTGCGCCT-3'，扩增产物大小为583 bp。后一段引物为HHyal2-F：5'-ACCGG CTGGGCATGTATCCAC-3' 和HHyal2-R：5'-GCTGG GTGAGACCCTTACGA-3'，扩增产物大小为1 195 bp。在目的片段全长中引入酶切位点及5' 末端融入HA标记，上游引物Hyal2-F：5'-CCAAGCTTCCTGCA GCCCCCAGCA-3'(Hin d Ⅲ)，下游引物：Hyal2-R：5'-GCTCTAGATTAGGCGTAATCGGGCACGTCGTA GGGGTACGAAGTCCAGGTGAAG-3'(XbaⅠ)，扩增产物大小为1 485 bp。

根据GenBank 中登录的绵羊及小鼠Hyal-2 基因序列，设计特异性强、能够区分二者的定量PCR 扩增引物。绵羊Hyal-2 基因特异性引物为JDHyal2-F：5'-GGTTTACCACCAGCAACG-3' 和JDHyal2-R：5'-G TAATCGGGCACGTCGTA-3'，扩增产物大小为450 bp。内参基因β-actin 引物为actin-F：5'-CATCCGTAA AGACCTCTATGCCAAC-3' 和actin-R：5'-ATGGAG CCACCGATCCACA-3'，扩增产物大小为170 bp。

1.4 重组表达质粒的构建及鉴定 以绵羊瘤胃组织提取的总RNA 反转录产物cDNA 为模板，利用引物QHyal2-F/QHyal2-R(退火温度：62 ℃)和HHyal2-F/HHyal2-R(退火温度：63.7 ℃)，按常规方法进行PCR 反应，分段扩增目的片段QH 和HH，构建重组质粒pMD-QH 和pMD-HH。以Pml Ⅰ和XbaⅠ分别进行双酶切，将QH 片段克隆于pMDHH 中构建含有完整Hyla-2 基因的重组质粒pMDHyal2，并测序鉴定。

以pMD-Hyal2 为模板，Hyal2-F/Hyal2-R(退火温度：63.9 ℃)为引物，进行PCR 扩增。将扩增后含有融合HA 标记的目的基因进行纯化，克隆于pcDNA3.1(+)中构建含有融合HA 标签序列的真核重组表达质粒pcDNA-Hyal2-HA，并测序鉴定。

1.5 建立稳定表达Hyal2-HA的NIH 3T3细胞系

1.5.1 G418 工作浓度确定 采用终浓度为100 mg/L～900 mg/L G418 加入NIH 3T3 细胞单层中，于37 ℃5%CO2条件下培养，每3 d 换液一次，共培养15 d～20 d，观察NIH 3T3 细胞生长情况。以细胞完全死亡的G418 最小浓度为筛选的最佳工作浓度。

1.5.2 稳定表达Hyal2-HA 细胞系的建立 按转染试剂Lipofectamine 2000 说明书方法，将0.8 μg pcDNA-Hyal2-HA 重组质粒转染至90 %～95 %融合的单层NIH 3T3 细胞中，以转染pcDNA3.1(+)为对照。转染48 h 后，以最佳工作浓度G418 完全培养液进行筛选。筛选4 d 后，以有限稀释法传代于96 孔板中继续培养，7 d 后挑选含有1 个细胞集落的孔，相继在24 孔板、6 孔板和细胞培养瓶中扩大培养，以间接免疫荧光(IFA)方法检测Hyal2-HA 的表达情况。对阳性转染细胞克隆进行连续3 次克隆纯化，使其免疫荧光阳性率达90 %以上。阳性克隆以150 mg/L 的G418 扩增培养传代，并于液氮冻存。

1.6 稳定表达Hyal2-HA细胞系的鉴定

1.6.1 实时荧光定量PCR 检测 采用试剂盒提取稳定表达Hyal2-HA 细胞系的总RNA，以反转录的cDNA 为模板，利用特异性引物JDHyal2-F/JDHyal2-R(退火温度：57 ℃)和内参基因引物actin-F/actin-R(退火温度：57 ℃)，按三步法进行实时荧光定量PCR 检测。以未转染的NIH 3T3 细胞cDNA 为阴性对照。

1.6.2 IFA 检测 将稳定表达Hyal2-HA 的细胞株以2×105个细胞/孔接种至24 孔板，同时以空载体转染的细胞为阴性对照；未做任何处理的NIH 3T3 细胞作为空白对照。以HA MAb(1∶100)为一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶500)为二抗，进行IFA 检测。

1.6.3 Western blot 检测 收集表达Hyal2-HA 的细胞，经RIPA 细胞裂解液提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE 分离后，转印至PVDF 膜上，以HA MAb(1∶1 000)为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)为二抗，ECL 发光显影进行western blot 检测。

1.7 JSRV囊膜蛋白诱导转化NIH 3T3-Hyal2-HA细胞系 按转染试剂Lipofectamine 2000 说明书方法，将28 μg pcDNA3.1-env 质粒分别转染NIH 3T3细胞和NIH 3T3-Hyal2-HA 细胞系，并设转染空载体pcDNA3.1(+)作为阴性对照，仅转染试剂作为空白对照。转染约12 h 后，以PBS 漂洗细胞3 次，并为细胞更换完全培养基，随后每3 d 为细胞换液并在显微镜下观察其形态。

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA-Hyal2-HA的构建 以绵羊瘤胃组织cDNA 为模板，分段扩增Hyal-2 基因。结果显示，扩增产物QH 约600 bp 和HH 约1 200 bp，与预期大小相符(图略)，并将其克隆至pMD18-T 载体中得到重组质粒pMD-QH、pMD-HH。双酶切处理并连接，经鉴定得到含有目的基因Hyla-2 重组质粒pMD-Hyal2(图 略)。以 pMD-Hyal2 为模板，Hyal2-F/Hyal2-R 为引物进行PCR 扩增，得到融合有HA 标签的Hyal-2 基因，全长约为1 500 bp，与预期大小相符(图略)。将目的基因与pcDNA3.1(+)连接，构建重组质粒pcDNA-Hyal2-HA。阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果显示，目的基因的读码框架和插入方向正确，与预期相符(图略)。

2.2 稳定表达Hyal2-HA细胞系的建立及鉴定 将重组质粒pcDNA-Hyal2-HA 转染NIH 3T3 细胞，以G418 最佳工作浓度300 mg/L 进行筛选。挑取G418抗性细胞克隆，经3 次有限稀释法纯化后，建立了稳定表达Hyal2-HA 细胞系NIH 3T3-Hyal2-HA。

提取NIH 3T3 细胞及第15 代的NIH 3T3-Hayl2-HA 细胞系总RNA，经反转录后进行三步法实时荧光定量PCR，以β-actin cDNA 作为内参进行相对定量，检测目的基因是否稳定高表达。结果显示，未转染的NIH 3T3 细胞未检测到绵羊Hyal-2 cDNA，而NIH 3T3-Hayl2-HA 细胞系检测到较高的绵羊Hyal-2 cDNA 表达量(图1)。

图1 实时荧光定量PCR 检测Hyal2-HA 在NIH 3T3-Hyal2-HA 中的表达Fig.1 Identification of Hyal2-HA protein expressed in NIH 3T3-Hyal2-HA cells by real-time PCR

将NIH 3T3-Hyal2-HA 细胞裂解后提取总蛋白，以抗HA MAb 进行western blot 检测。结果显示，在55 ku 处可见特异性条带，大小与预期相符，而未转染的NIH 3T3 细胞空白对照未见阳性反应条带(图2)。

以HA MAb 为一抗，羊抗鼠IgG-FITC 为二抗，分别对NIH 3T3-Hayl2-HA 细胞系和NIH 3T3 细胞进行IFA 检测，结果显示，NIH 3T3-Hayl2-HA 细胞转染后第一代即能呈现较强的绿色荧光，并且荧光主要集中于细胞膜上，在胞核及胞质中仅见微弱荧光，对照细胞则无荧光(图3A)。将该细胞克隆传代至15 代，其仍能够稳定表达Hyal2-HA 蛋白(图3B)，而且阳性细胞率在可见范围内为100 %(图3C)。

图2 Western blot 检测Hyal2-HA 在NIH 3T3-Hyal2-HA 中的表达Fig.2 Identification of Hyal2-HA protein expressed in NIH 3T3-Hyal2-HA cells by western blot

图3 IFA 检测Hyal2-HA 在NIH 3T3 细胞中的表达Fig.3 Identification of Hyal2-HA expressed in NIH 3T3 cells by IFA

2.3 JSRV囊膜蛋白诱导转化NIH 3T3-Hyal2-HA细胞系 重组质粒pcDNA3.1-env 转染3 周后，在显微镜下分别观察NIH 3T3 细胞和NIH 3T3-Hyal2-HA细胞系的细胞形态。结果显示，JSRV 囊膜蛋白可以诱导NIH 3T3 细胞形成典型的转化聚积灶(图4A)；而JSRV 囊膜蛋白对NIH 3T3-Hyal2-HA 细胞系无影响，并未使其形成转化聚积灶(图4B)。表明在NIH 3T3 细胞中，绵羊Hyal-2 蛋白抑制了JSRV囊膜蛋白的诱导转化作用。

图4 JSRV 囊膜蛋白诱导转化NIH 3T3 细胞及NIH 3T3-Hyal2-HA 细胞系Fig.4 Envelope protein of JSRV induced NIH 3T3 cells and NIH 3T3-Hyal2-HA cell line

3 讨论

近年来研究表明，在NIH 3T3 细胞中，JSRV囊膜蛋白(Env)与鼠Hyal-2 不结合，并且其不表达鼠源RON/Stk，过表达鼠Hyal-2 对JSRV Env 转化能力无影响[6]；而在表达人Hyal-2 的NIH 3T3 细胞中，JSRV Env 的转化能力却受到了明显的抑制[7]。由此推断，在NIH 3T3 细胞中，不同种属来源的Hyal-2对JSRV Env 转化能力的影响存在差异。因此，只有在表达绵羊Hyal-2 的NIH 3T3 细胞中，才能更具体的了解绵羊Hyal-2 对JSRV Env 诱导转化能力的影响。

NIH 3T3 小鼠成纤维细胞自身表达鼠源Hyal-2，并且绵羊与小鼠Hyal-2 的氨基酸序列同源性较高，因此需要特异性较好、无种属间交叉免疫反应的MAb 才能够将二者在蛋白水平上加以区分。目前市场上商品化的主要是Hyal-2 多克隆抗体，不同种属间存在交叉免疫反应，不适用于区分不同种属来源的Hyal-2。本实验选取对目的蛋白功能影响较小，只有9 个氨基酸的HA 标签，融合表达于Hyal-2 的C 端，构建了含有绵羊Hyal-2 基因编码区全长的pcDNA-Hyal2-HA 真核表达重组质粒；利用该重组质粒建立了稳定表达JSRV 受体绵羊Hyal-2 的NIH 3T3 细胞系NIH 3T3-Hyal2-HA。并且证明，在该细胞系中，绵羊Hyal-2 蛋白抑制了JSRV 囊膜蛋白诱导转化NIH 3T3 细胞，这与人Hyal-2 蛋白的作用相同[7]，但其具体的作用机制还需进一步研究。该细胞系的建立为进一步研究JSRV 与其受体的相互作用致瘤机制奠定了基础。

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