门冬氨酸钾对局灶性脑缺血再灌注大鼠的保护作用研究

顾漪，赵育梅，龚磊，于航，王拥军，张亚卓

凋亡是缺血性细胞死亡的常见模式[1]，是引起细胞皱缩，脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）损伤及最终的吞噬性死亡的一系列明显的形态学和生化学改变。多种外源性和内源性刺激均能触发凋亡，而K+外流的增加被证明是早期凋亡性细胞皱缩和下游Caspase酶激活以及DNA片段化的重要介质[2]。钾离子是细胞内重要的阳离子，参与大量酶促反应和肌肉收缩过程。研究显示门冬氨酸对细胞有很强的亲和力，并能增加K+内流[3]。本研究旨在观察门冬氨酸钾（potassium aspartate，PA）对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡是否有保护作用，从而为K+在缺血性脑血管病的治疗提供转化医学的依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象和分组 研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重300～330 g［北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。PA：原料药，每瓶5 g（批号100602），辽宁药联制药有限公司］。

采用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，缺血2 h，再灌注22 h，制模成功的50只大鼠随机分为PA 10 mg/kg组、PA 25 mg/kg组、PA 62.5 mg/kg组、PA 125 mg/kg组和溶剂对照组。在缺血造模后1 h按1 ml/kg给药体积腹腔注射给予各组药物，溶剂对照组给予生理盐水（批号11033042，天津药业焦作有限公司）。各组大鼠在制模成功后24 h麻醉处死取脑，行氯化2，3，5-三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色，比较各组的脑梗死体积。

另取制模成功的32只大鼠随机分为生理盐水组（1 ml/kg）和门冬氨酸钾组（62.5 mg/kg），另外设立假手术组16只，每组药物均在缺血后1 h经腹腔注射给药（药物剂量为1 ml/kg），假手术组给予生理盐水（1 ml/kg）。制模成功后24 h麻醉处死取脑，比较3组脑组织的三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）、乳酸含量以及细胞凋亡情况。

1.2 制模方法和成功标准 按400 mg/kg剂量腹腔注射10%水合三氯乙醛胶浆（北京天坛医院制剂，京药制字H20083287）麻醉，以仰卧位放置在37℃恒温板上。采用线栓法制作右侧MCAO模型[4]。具体方法为，在手术显微镜下经颈正中切口，暴露双侧颈外动脉和颈内动脉。线栓经颈外动脉断端进入颈内动脉，向内延伸约20 mm直到感到抵触感，此时线栓的头部越过大脑中动脉的起始端，并阻断大脑中动脉的血流。脑缺血2 h后线栓被拔出至颈外动脉的断端，再灌注22 h。假手术组线栓在颈外动脉断端处被结扎，不再向颈内动脉延伸，其余手术过程与另两组相同。术后4 h按照Schmid-Elsaesser等[5]使用的神经行为评分法进行评分，评分1～4分造模成功。将造模成功的大鼠纳入研究，造模失败的大鼠去除，重新造模补充。

1.3 试验方法

1.3.1 神经功能行为评分 在脑缺血后24 h，采用Schmid-Elsaesser等使用的行为评分方法，对各组动物进行神经功能行为的评分[5]。评分标准为，0分：无自发活动；1分：行走时自发向对侧旋转；2分：拉尾行走时向对侧旋转；3分：向对侧侧推时抵抗能力降低；4分：提尾悬空时对侧前肢屈曲；5分：无神经功能缺损症状。

1.3.2 TTC染色及梗死体积测量 缺血后24 h，动物按400 mg/kg剂量腹腔注射10%水合三氯乙醛胶浆麻醉后，断头处死。迅速取出脑组织，检查并确定没有蛛网膜下腔出血。将脑组织切为2 mm厚的冠状切片，在37℃水浴中与1%TTC（Sigma-Aldrich，美国）溶液避光孵育20 min，再于10%甲醛溶液中固定10 min。将TTC染色后的6张脑片照相后保存，以进行损伤区域的测量。采用图像分析系统（HMIAS-2000，北京空海科技发展公司）计算未被TTC染色的区域，即脑缺血损伤区域。总梗死体积的计算方法为6张脑片未染色的面积总和乘以脑片厚度。

1.3.3 脑组织收集和处理 脑缺血后24 h，动物以10%水合氯醛麻醉，断头处死，迅速取出脑组织。留取距额极前端3 mm的冠状脑片，脑片厚度为4 mm，然后在中线右侧2 mm处纵形切开，留取右侧半球的脑组织[6]。所留的脑组织进行匀浆，用于相应的检测。组织蛋白含量的测定使用考马斯亮蓝法。每组随机取10只大鼠进行脑组织ATP和乳酸的含量测定。其余每组6只大鼠断头处死后，脑组织以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后用于末端转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate nickend labeling，TUNEL）检测。

1.3.4 脑组织ATP和乳酸含量的测定 脑组织ATP和乳酸含量的测定分别使用ATP检测试剂盒和乳酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

ATP含量测定步骤为：设立标准管、标准空白管、测定管和对照管，标准管和标准空白管加入30 μl 1 mmol/L ATP标准液，测定管和对照管加入30 μl待测样本；依次加入底物液Ⅰ，底物液Ⅱ，于标准管和测定管中加入促进剂，标准空白管和对照管中加入蒸馏水，使反应总体积为360 μl，混匀后37℃水浴30 min；再加入沉淀剂50 μl，充分混匀后，4000 rpm离心5 min；取各管上清液300 μl，加入显色液500 μl，混匀，室温静置2 min；加入终止剂500 μl，混匀，室温静置5 min；使用TECAN Infinite M200酶标仪，于波长636 nm处测定吸光度值。

乳酸含量测定步骤为：于空白管加入10 μl蒸馏水，标准管加10 μl 3 mmol/L乳酸标准液，测定管加10 μl待测样本；依次加入酶工作液0.5 ml和显色剂0.1 ml，混匀，37℃反应10 min；加入终止液1 ml，混匀；用酶标仪于波长530 nm处测定吸光度值。

1.3.5 TUNEL法检测细胞凋亡 每只大鼠取第一躯体感觉皮质区的3张切片，使用原位细胞凋亡检测试剂盒（No.11684817910，罗氏诊断产品有限公司，德国）进行分析。8 μm厚的冠状切片经脱蜡、复水后用蛋白酶K（10 μg/ml）室温孵育30 min。在每个样本上加入50 μl TUNEL反应混合液，37℃避光反应60 min。切片使用过氧化物酶转换剂和3，3’-二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）底物显色，苏木精复染后，光镜观察。每个样本在梗死灶周边区随机选取10个高倍视野进行TUNEL阳性细胞的计数，结果以10个高倍视野计数的平均值表示。

1.4 统计学分析 神经功能行为评分的数据为偏态分布，以中位数和四分位数表示，其他数据为正态分布，以均值±标准误（ ±σ）表示。神经功能行为评分的数据用Kruskal-Wallis检验分析，其余各组之间比较采用单因素方差分析以及Dunnett和S-N-K检验。P＜0.05被认为差异有显著性。

2 结果

2.1 门冬氨酸钾对局灶性脑缺血再灌注后梗死体积的影响 不同剂量门冬氨酸钾组和溶剂对照组大鼠的神经功能行为评分之间差异有显著性（KW=26.59，P＜0.001）（表1）。与溶剂对照组比较，62.5 mg/kg剂量的门冬氨酸钾能提高大鼠的神经功能行为评分（P＜0.001）；门冬氨酸钾10 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg剂量组的神经功能行为评分与对照组差异无显著性，门冬氨酸钾各剂量组的神经功能评分两两比较差异无显著性。各组大鼠的梗死体积之间差异有显著性（F=3.429，P=0.016）（表1），Dunnett检验显示与溶剂对照组相比，25 mg/kg（q=2.630，P=0.040）和62.5 mg/kg（q=3.128，P=0.011）剂量的门冬氨酸钾能降低缺血大鼠的脑梗死体积。10 mg/kg和125 mg/kg剂量门冬氨酸钾组的梗死体积也小于溶剂对照组，但无显著性差异；门冬氨酸钾各剂量组的梗死体积两两比较差异无显著性。图1为大鼠局灶性脑缺血再灌注后的脑组织TTC染色图。

2.2 门冬氨酸钾对脑组织ATP和乳酸含量的影响 门冬氨酸钾、溶剂对照和假手术3组大鼠的脑组织ATP含量差异有显著性（F=6.701，P=0.004）（表2），S-N-K检验显示溶剂对照组大鼠的ATP含量低于假手术组（q=5.139，P=0.001），而与溶剂对照组相比，门冬氨酸钾能提高脑组织的ATP含量（q=3.116，P=0.036），门冬氨酸钾组与假手术组差异无显著性。3组大鼠的脑组织乳酸含量差异有显著性（F=4.341，P=0.023）（表2），S-N-K检验显示与假手术组比较，溶剂对照组（q=3.942，P=0.010）和门冬氨酸钾组（q=3.142，P=0.035）大鼠的乳酸含量均明显升高；门冬氨酸钾组的乳酸含量低于溶剂对照组，但两组之间差异无显著性。

2.3 门冬氨酸钾对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响 TUNEL阳性细胞为细胞核出现致密的标记，并显示出凋亡的形态学特征（图2）。在溶剂对照组大鼠的右侧躯体感觉皮质区可见大量黄褐色的TUNEL染色阳性细胞（图2），而假手术组TUNEL染色为阴性（图2A）。3组大鼠的凋亡阳性细胞计数值差异有显著性（F=413.1，P＜0.001）（表3），S-N-K检验显示与假手术组比较，溶剂对照组（q=40.38，P＜0.001）和门冬氨酸钾组（q=27.94，P＜0.001）的TUNEL阳性细胞数均增加；与溶剂对照组相比，给予门冬氨酸钾处理后能减少缺血后24 h的TUNEL阳性细胞数（q=13.91，P＜0.001）（图2）。

3 讨论

表1 门冬氨酸钾对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经功能评分和梗死体积的影响

表2 门冬氨酸钾对缺血再灌注后脑组织ATP和乳酸含量的影响

研究显示K+过度外流和细胞内K+缺失是细胞凋亡的早期关键步骤[7-8]。在正常细胞，胞浆的K+浓度在140～150 mmol/L之间，而当凋亡发生时，K+浓度将下降到70～80 mmol/L[9]。据报道，用四羟乙基铵减弱K+外流或者提高细胞外的K+浓度能减少细胞凋亡[10]。Yushmanov等[11]用组织化学成像研究发现在大鼠局灶性脑缺血核心区的周边区域能观察到典型的K+下降和Na+以最大速度增加。门冬氨酸钾对缺血再灌注大鼠脑细胞ATP/K+含量及细胞凋亡的影响已有报道[12]，该研究发现大鼠局灶性缺血20 min、60 min和再灌注15 min、60 min的脑ATP和K+含量均降低，梗死灶周边凋亡细胞数目明显增多；门冬氨酸钾能显著阻止脑梗死范围扩大，改善再灌注后脑组织能量代谢与K+状态。

在本研究中，缺血后24 h脑组织TTC染色结果显示，门冬氨酸钾组动物的梗死体积降低，特别是在25 mg/kg和62.5 mg/kg的剂量。该结果提示门冬氨酸钾对局灶性脑缺血再灌注有保护作用。然而，在125 mg/kg剂量时，门冬氨酸钾组仅表现为有降低缺血损伤的趋势。其可能的原因是，药物的有效剂量通常在一定范围内，超出该范围的剂量可能会导致不同的效应。此外，尽管125 mg/kg剂量远低于门冬氨酸钾的半数致死量，该剂量一般不会造成对动物和人体的毒性作用；但有研究表明细胞在高K+培养基中孵育能诱导细胞凋亡[13]，这可能是125 mg/kg剂量的门冬氨酸钾减少梗死体积的作用不如25 mg/kg和62.5 mg/kg剂量的原因。

表3 大鼠脑缺血24 h后躯体感觉皮质区的TUNEL阳性细胞计数

脑缺血后组织ATP含量的迅速下降并引起继发性脑损伤已被证实[14]。门冬氨酸能形成草酰乙酸，参与三羧酸循环和尿素循环，生成ATP，为机体供能。在本研究中，门冬氨酸钾能减少脑缺血后的ATP下降，这可能与门冬氨酸的作用有关。同时，我们的研究结果表明，与假手术组比较，溶剂对照组的乳酸含量明显增加并有显著性，是因为在缺氧条件下，糖酵解产生的丙酮酸通过乳酸途径进一步代谢。因此，在缺血组织中，乳酸的含量应该上升。然而，与溶剂对照组比较，门冬氨酸钾组的乳酸含量无明显下降，其可能原因是：脑缺血后细胞的有氧代谢迅速降低，虽然给予门冬氨酸钾能在一定程度上减轻缺血性损伤，但大部分细胞仍处于低氧环境下，而导致乳酸含量增加；此外，Zilberter等[15]证实在集中的突触活动下葡萄糖不足以作为能量载体，乳酸能成为维持和增强体外脑组织有氧代谢的有效底物，该结果也支持门冬氨酸钾组高乳酸水平的可能性。

TUNEL染色的结果表明，门冬氨酸钾能明显减轻大鼠缺血后躯体感觉皮质区的细胞凋亡，提示该药物对局灶性脑缺血再灌注的保护作用可能通过细胞凋亡的途径产生，其机制有待进一步研究证实。

图2 大鼠脑缺血24 h后躯体感觉皮质区的TUNEL染色细胞光镜图（200×）

大量的神经保护药物在动物的卒中研究中被证明有效，但几乎每种药物在进入临床试验后都以失败告终[16]。门冬氨酸钾作为一种电解质补充剂，已在临床治疗中使用，应该具有较好的安全性。本研究发现门冬氨酸钾对大鼠局灶性脑缺血再灌注具有保护作用，这种作用可能通过细胞凋亡的途径产生。但本研究仍存在不足，首先，在动物建模方面，受条件所限，我们在研究中使用水合氯醛进行麻醉，动物的苏醒时间在2 h以后，而为了在缺血早期尽早保护半暗带并且符合临床对缺血发生后的最早治疗时间，我们的给药时间在缺血后1 h，这样在缺血后治疗前不能进行有效的神经功能评分，可能对判断大鼠是否造模成功有一定影响；今后我们将采取气体麻醉法，这样大鼠会快速苏醒，能够在缺血后采取治疗前进行评分，从而避免治疗前存在的造模差异。其次，门冬氨酸钾对细胞凋亡的影响究竟是抑制细胞凋亡还是延缓了凋亡的发生，这需要大鼠脑缺血后观察至7 d的实验来验证。另外，门冬氨酸钾对脑缺血后细胞凋亡的时间效应作用也有待完善。

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