扑草净在养殖水体中的生态毒理效应及其微生物降解的研究进展

2014-03-07张骞月

生物灾害科学 2014年1期

张骞月，吴伟,2*

（1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/中国水产科学研究院内陆渔业生态环境与资源重点开放实验室，江苏无锡 214081）

0 引言

近年来，随着农业的栽培耕作方式趋向于规模化和集约化，病虫害防治对农药的需求量逐年显著增加。其中，除草剂研发、使用的频率明显高于杀虫剂和杀菌剂的发展水平，约占到农药产量的1/3[1]，是目前世界众多农药种类中使用量最大、施用面积最广、毒性最高的一类药物。除草剂的大面积推广应用促进了精耕农业和效益农业的发展，但同时其污染效应也扩展到整个生态系统。由于除草剂多数具有一定的残效期，而且可以在生物机体内富集，因此其对生态环境的影响已引起世界各国的重视。

扑草净属均三氮苯类除草剂，化学性质稳定，半衰期长，难降解，容易随着降水、淋溶和径流的作用，由土壤迁移入水体。在20世纪70年代，扑草净开始被用于池塘水产养殖中清除杂草和青苔，因此其在水体环境中具有一定的残留量。其不仅可直接对水生植物和浮游植物的生存状态产生显著影响，对鱼类等水生动物表现出一定的毒理效应，而且可通过微型生物的降解作用产生一系列具有潜在毒理效应的代谢产物。这些物质的存在都有可能通过食物链及食物网的传递对水生态环境中的各级生物造成急性、慢性或遗传毒性，从而引发水生态系统中生物种群的结构和数量发生改变[2]。扑草净应用于水产养殖水体中，虽然在清除水体杂草、青苔等方面取得了显著成效，但同时给养殖水环境造成了严重的污染，因此了解扑草净在养殖水体中的生态毒理效应及其微生物降解的可能性显得尤为重要。

1 扑草净的理化性质及其应用概况

扑草净（prometryne），又称扑草净胺、捕草净、割草佳、扑蔓尽，化学名称为4,6-双异丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，为均三氮苯类选择性除草剂，分子式为C10H19N5S[3]，结构式为：

扑草净纯品为白色结晶，易溶于有机溶剂，20 ℃时在水中的溶解度为48 mg/L，熔点18～120 ℃，具有臭鸡蛋味。工业原粉是浅灰色粉末，是一种高效低毒的内吸型除草剂。因其具有类似于苯环的结构，故化学性质稳定，能够长期存在于环境和生物体中，半衰期为1～3个月，在施用多年的田间可稳定存在12～18个月，休药期不低于500度日[4]。植物自身对扑草净的降解十分缓慢，且扑草净会抑制植物分泌释放的各类生物酶的活性[5]。其作用机制是抑制植物的光合作用，妨碍糖分的形成和淀粉的积累，使植物因缺乏养分而死亡。在农业生产中扑草净主要用于大豆、麦类、花生、果树、蔬菜及水稻田等防除稗草、野苋菜、马齿苋、车前草等1年生禾本科及阔叶草，是农业生产使用较为广泛的除草剂；而在水产养殖业中主要用于清除鱼、虾、蟹、贝、海参等养殖水体中的丝状藻类（青苔）、大型草类及有害藻类[6]。养殖池塘中水草的过度繁生会产生一系列的不利影响，如不利于拉网操作、降低水体肥度、降低池水温度、不利于饵料的有效利用等，不少鱼苗池就是因为水草的危害而养不了鱼苗。为了割除水草，每年都得耗费大量人力物力。同样，养殖池塘中的丝状藻类（青苔）也存在着诸多危害。因扑草净在清除水体中杂草和丝状藻类方面有着显著的效果，从20世纪70年代起，其在养殖水体中的用量快速增长，但过度的使用势必会污染水环境和危害养殖生物，破坏生态平衡[7]。

2 扑草净对养殖水体中水生生物的生态毒理效应

许多养殖池塘特别是鱼种池，杂草丛生，在消耗大量养分的同时，夜间还会消耗大量溶氧，致使养殖鱼种因缺氧而浮头，因此常选用除草剂-扑草净来解决此类问题。故扑草净对养殖水体中水生动植物的生态毒理效应的研究越来越受重视。

2.1 扑草净对养殖水体中水生动物的毒理效应

谢剑等的试验表明[7]，扑草净对凡纳滨对虾24、48、72和96 h的LC50分别为27.86、19.95、12.02和8.91 mg/L，安全浓度（SC）为0.89 mg/L；而对罗氏沼虾24、48、72和96 h的LC50分别为33.50、23.44、16.90和13.03 mg/L，SC为1.30 mg/L。罗氏沼虾对扑草净的耐药性要强于凡纳滨对虾。按毒性分级标准，扑草净对虾类的毒性为中毒-高毒性[8]。

据食品数据库中的农药基本信息显示，扑草净对虹鳟鱼的96 hLC50为5.5 mg/L，对蓝鳃太阳鱼的96 hLC50为7.9 mg/L。含扑草净的废水对鱼类的24～96 hLC50值随着降解时间的推移而逐渐增大，即其对鱼类的急性毒性逐步降低，由高毒性废水转变为中弱等毒性的废水。

扑草净进入水体后影响到鱼类食物链的各个环节，间接影响到鱼类的生长。我国的水产养殖以鲤科鱼类为主，滤食性的鱼以浮游植物为生，草食性鱼以水生植物为生，杂食性鱼以底栖生物为生，但是在幼鱼阶段都食浮游动物。研究表明，扑草净对枝角类-大型溞的48 hLC50为12.66 mg/L。大量使用的扑草净仅有少部分被植物吸收，有实验表明，在扑草净的使用过程中，作用于靶标植物的量不超过1%，而剩余99%的除草剂则随着吸附作用、地表径流、雨水冲刷等方式进入水体环境中，进而会在生物体内产生富集。通过食物链大量蓄积于鱼体内的除草剂则会直接影响鱼类的生长和繁殖[9]。同时，扑草净除草的机理是抑制植物的光合作用，其进入养殖水体后可间接使水体中的溶解氧减少，影响鱼类的正常生活。

2.2 扑草净对养殖水体中水生植物的毒理效应

藻类在水生生态系统中起着重要的作用。作为地球上最重要的初级生产者，据估计藻类植物每年光合同化生产的总有机碳约13.5×1010t，比陆生高等植物生产的总有机碳约高7倍多。藻类能通过光合作用，为无脊椎动物、鱼类、水鸟等生物提供O2、食物。藻类在光合作用过程中放出的氧气是水体中氧的最重要来源，以供应鱼类和其它动植物的需要，其种类多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能。因此藻类的存在无论是对水体生产力还是水体污染的自净作用均具有十分重要的意义。

藻类个体小，繁殖快，容易获得，而且对毒物有着高度的敏感性，不同的藻类对毒物的敏感性强度存在着较为显著的差异。当某一水体被污染时，较敏感的藻类会首先受到影响，进而消减，所以藻类是反映水体污染程度的良好指标。

黄诚等[10]试验表明：椭圆小球藻对酰溴苯腈、辛酰溴苯胺、禾草灵、西玛津、西草净、扑草净、莠灭净、绿草定、草净津、除草通等10种除草剂的毒性分别在第4、6、3、7、6、5、8、4、5和4天达到最大，各浓度最大抑制率范围为：18.33%～68.46%、34.84%～70.77%、19.76%～66.07%、54.37%～98.72%、37.88%～97.77%、72.97%～98.81%、36.17%～99.75%、41.03%～97.44%、35.09%～98.58%、88.04%～95.18%；低浓度的除草剂对该藻都表现出一定的生长促进作用；10种除草剂对椭圆小球藻的毒性大小顺序为：莠灭净>扑草净>西草净>西玛津>除草通>草净津>禾草灵>辛酰溴苯胺>辛酰溴苯腈>绿草定。试验中又选取了螺旋鱼腥藻，类似的结果也出现：上述10种除草剂的毒性分别于第3、4、4、5、3、4、5、3、5和2天达到最大，扑草净浓度最大抑制率范围为：83.98%～95.75%；扑草净生长促进大小范围依次是：11.04%～36.63%；10种除草剂对螺旋鱼腥藻的毒性大小顺序为：莠灭净>扑草净>草净津>西草净>西玛津>辛酰溴苯腈>禾草灵>除草通>辛酰溴苯胺>绿草定。扑草净对螺旋鱼腥藻的毒性大，但在浓度为0.02 mg/L时表现出高达36.63%的生长促进作用。

谢剑等[7]试验表明，扑草净对金鱼藻的240 hEC50为0.13 mg/L，对轮叶黑藻的240 hEC50为0.02 mg/L，表明扑草净对金鱼藻的毒性要弱于轮叶黑藻。在凡纳滨对虾和罗氏沼虾的养殖池塘，应用扑草净清除金鱼藻和轮叶黑藻等沉水性植物，浓度为0.02～0.89 mg/L时，效果最佳。另有试验表明莱茵衣藻对扑草净有一定的生物富集和生物降解作用，莱茵衣藻能显著减少培养基中扑草净含量，且对扑草净有很强的富集能力，同时，低浓度的扑草净会刺激莱茵衣藻的生长，而高浓度时则会产生抑制作用。李雪芹等[11]研究表明，扑草净对蛋白核小球藻也会产生相类似的效果，在单种毒性效应下，扑草净对蛋白核小球藻的EC50是0.164 mg/L。

水绵是一种不分枝的丝状藻类，为双星藻科水绵属，常见于池塘、缓慢流动的河水中。少量的水绵在某种程度上可以起到净化水体的作用；但大量的水绵腐烂变质后，将严重影响水质，破坏生态平衡，使鱼虾繁盛的水体变为一湾“死水”。POD和SOD为植物体内2种清除自由基的关键酶，在水绵受到扑草净处理时，其浓度具有明显变化。廖金花等[12]研究发现，扑草净是通过使SOD和POD活性下降造成植物体内自由基积累，而引起对植物体的伤害。

3 扑草净的微生物降解及其研究进展

3.1 扑草净的微生物降解研究进展

最早关于均三氮苯除草剂的微生物降解研究报道见于1963年。Kaufman[13]利用14C标记侧链的均三氮苯溶液进行微生物培养时，释放出了14CO2，证明了均三氮苯侧链进行了脱烷基作用。后来许多试验表明存在于环境中的均三氮苯类除草剂在一开始会对微生物表现出较强的攻击能力，因此较难降解。但是随着环境条件的不断变化，微生物在与除草剂长期接触后，会增强其对除草剂的适应能力，包括自发的产生突变菌株或形成新的诱导酶系[14]，因而能够对除草剂的降解起到明显的效果。这些研究为扑草净的微生物降解提供了可能的途径。均三氮苯类除草剂生物降解不仅要受微生物种类、数量、分布、均三氮苯类除草剂浓度、分子量和化学结构的影响，还会受到环境条件如通气状况、温度、湿度、营养条件、酸碱度所影响[15]。均三氮苯类除草剂微生物降解研究至今约50年,现已发现多种细菌、真菌、放线菌、藻类可以降解与转化均三氮苯类除草剂。目前已发现能够降解均三氮苯类除草剂的微生物达24种，其中真菌18种，细菌5种，放线菌1种。

扑草净作为被广泛应用的除草剂，其微生物降解研究也取得一定的进展。目前已发现的可降解扑草净的微生物种属有：假单胞菌属（Pseudomonas）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属（Escherichia）；头孢霉属（Cephalosporium），曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和枝孢霉属（Cladosporium）。颜慧等[16]报道了假单胞菌属细菌FR对扑草净的降解率可达60%～70%左右。菌株FR对扑草净的降解是诱导性的，它对扑草净降解的最适环境条件为pH7.0，32 ℃。

大量研究表明，微生物在降解残留于环境的除草剂中发挥了重要的作用，微生物降解是目前治理残留除草剂污染的有效手段之一，利用微生物及其降解酶对环境中残留的除草剂进行净化处理已显示出良好的应用前景[17]。

3.2 微生物对扑草净的降解途径

微生物对扑草净的降解机理主要是通过其分泌的酶的代谢来完成，其本质为酶促反应，包括：广谱性酶的偶然性代谢、由基质结构与扑草净相似的酶进行的共代谢，以及由利用扑草净作为能源的适应酶进行的降解代谢。综合来说，扑草净微生物降解的途径包括氧化、还原、水解、脱卤、缩合、脱羧、异构化等[18]。

在水生态环境中微生物对扑草净的作用方式为两类[19]：一是直接作用，即微生物直接作用于扑草净，由酶促反应引起，即微生物的代谢，主要包括：（1）共代谢。扑草净的生物降解反应就是酶促反应。在多步骤的酶促反应过程中，各种酶对底物的专一性强。底物被多步反应分解时，产生了某些中间态的化学分子，往往只是原体化合物发生的部分改变，并不能被专一性强的酶所降解。但在自然条件下，共代谢产生的中间产物往往可被其它微生物种群或物理化学因子所降解。（2）生物浓缩，即指微生物菌体细胞通过吸附和吸收的过程积聚水环境中残留的扑草净，扑草净在被吸收的同时往往也可能被转化，从而减少对环境的污染。二是间接作用，是指微生物的活动改变了周围的环境从而间接作用于扑草净。如微生物的作用改变了水体或沉积物微环境中的pH，降低氧化还原电位造成还原的环境，均可引起扑草净的次生化学降解。

4 影响微生物降解扑草净的因素

微生物降解扑草净的速率决定于内因和外因，内因包括扑草净本身因素和微生物本身因素，外因是环境的物理、化学及生物学条件。

扑草净的自身结构决定了其溶解性，影响其能否被微生物所摄取。扑草净化学结构中所含的氮、氢等原子，会降低其生物降解性，这类基团的数目越多，生物降解性越差。扑草净的化学结构还决定了其被微生物降解的速度[20-21]。微生物的种类、数量、代谢活性、适应性等都直接影响到对扑草净的降解与转化，不同的微生物种类或同一种类的不同菌株对扑草净的反应都不同。微生物具有较强的适应和被驯化的能力，扑草净能诱导微生物产生相应的酶系来降解它，或通过基因突变等建立新的酶系来降解它。微生物自身的功能特性和变化是影响降解最重要的因素。

而像pH值、温度、湿度、含C和N等有机质的含量、盐度、基质的吸附作用、黏度及通气量等环境因子，均可影响微生物对扑草净的降解能力。pH偏酸性时，利于真菌繁殖，pH偏碱性或中性时，利于细菌繁殖。大多数微生物有最适生长温度，降解酶也有最适反应温度。温度的改变可以影响微生物的代谢、降解酶的活性，甚至还能影响扑草净的物理状态，从而影响降解速率。在湿润、有机质含量丰富、通气良好的环境中，利于好氧或兼性厌氧微生物的生长，从而提高降解效率。

5 微生物降解扑草净存在的问题

虽然微生物降解扑草净研究已经取得了很大的进展，而且也有了一些应用的实例，但研究大多局限在实验室中，要完全走出实验室到实际应用中还有一段路要走，微生物降解扑草净方面存在一定的问题：（1）单一微生物不适应自然界复杂的环境条件。现阶段，扑草净的微生物降解研究主要是在实验室单一菌种纯培养的条件下进行的，在实验室内获得纯培养的菌株，然后研究它的特性、降解机理等，这与自然生态中农药污染的降解行为相去较远。扑草净往往存在于复杂环境中，自然状态下多种微生物共存，通过微生物之间的共同作用把扑草净降解，很可能出现扑草净单一株菌的降解活性到了复杂条件下可能无法生存或起不到期望作用的情况。活性微生物在自然界的生存能力和降解活性都需要进一步研究，所以必须确定所筛选的菌种是否属于常驻优势菌种。（2）扑草净及其降解产物对环境的污染影响是不同的。有些剧毒农药或除草净，一经降解就失去了毒性；而另一些农药或除草净，虽然自身的毒性不大，但它们的分解产物毒性很大；还有一些，其本身和代谢产物都有较大的毒性。所以在评价扑草净经微生物降解前后对养殖水体环境的污染影响时，不仅要看扑草净自身的毒性，而且还要注意其代谢产物是否具有潜在的危害[21]。

6 微生物降解扑草净的发展前景

目前各国科研工作者已分离出了可降解扑草净的菌种资源，并成功构建了各种工程菌株。但是如何建立菌种资源库，加强菌种资源和基因资源的整合，实现环境修复的规模化和集约化，避免造成二次污染，保障生物工程菌使用安全等仍是当前面临的重要课题。我国在养殖水体环境生物修复领域的研究比较领先，但是相关数据库的建立却非常落后。在目前农业生产对除草剂依赖程度还很高的情况下，充分发挥微生物对环境的修复潜力，整合各方面科研力量，对解决环境中的扑草净的残留问题具有重要的理论意义和现实意义。

7 结论

随着我国农业的快速发展，均三氮苯类除草剂在农业中的应用日益广泛。近年来关于扑草净的研究报道也逐年增多。扑草净对水生动植物、两栖类生物、哺乳动物、人类细胞等都有不同程度的损害作用，具有一定的生物毒性，达到一定浓度时能抑制多种藻类的光合作用及生长，从而引起水生生态系统中食物链的改变，影响生态平衡。

利用微生物来降解扑草净的研究国内已取得了一定的业绩，但目前仍属探索和初步应用阶段，具有十分广阔的应用发展前景。国外许多学者的研究表明，微生物降解处理扑草净具有物理、化学方法无可比拟的优越性：成本低、操作条件广泛、处理效果好等优点，能达到对污染清洁修复的目的。随着生物技术的发展，如何筛选和构建出高效菌株，大幅度提高微生物降解扑草净的能力以及修复污染的水体等等仍然是专家学者们致力研究的热点问题。

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