拮抗罗非鱼养殖水体中海豚链球菌功能性微生物的筛选

瞿建宏，陈 辉，吴 伟,*

（1.中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心/中国水产科学研究院内陆渔业生态环境与资源重点开放实验室，江苏 无锡 214081；2.南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081）

罗非鱼原产于非洲，因具有生长快、个体大、病害少、肉质营养丰富等特点，广受世界各国消费者和养殖业者的青睐，已成为世界性养殖的经济水产动物，被FAO列为人类六大主食品之一[1]。近几年来，随着罗非鱼养殖规模的不断扩大，养殖密度不断提高，罗非鱼病害时有发生，其中链球菌病是罗非鱼主要的病害之一。据研究，养殖生态环境的恶化，特别是养殖水体中氨氮、亚硝酸盐含量的增加，是罗非鱼链球菌病爆发的诱因。不良生境不仅可直接危害养殖鱼类，使鱼体的免疫力下降，增加了细菌的易感性，而且也为病原菌的增殖和传播提供了有利条件[2]。因此，从环境控制角度，寻求一种既能优化养殖水体环境又可抑制病原菌爆发性生长的有效方法显得意义重大。

传统的鱼病防治方法是使用药物防治，抗生素等化学药物的使用一方面带来了显著的防治效果，但同时也会因使用不当造成病原菌的耐药性增强、药物残留等问题。既破坏了生态平衡，又造成了水产品质量安全问题，而以微生态制剂为主的生物防治方法，避免了抗生素等化学药物带来的潜在危害，满足了环境友好型水产养殖的要求，日益受到养殖业者的高度关注。在水产养殖中，微生态制剂不仅可以作为添加剂添加于饲料，还可以直接添加于水体中[3]，起到净化养殖水质、优化养殖水域生态结构、抑制水体中病原菌的生长、提高养殖生物的免疫力，使养殖活动良性循环发展。目前已有乳杆菌（Lactobacillussp.）、芽孢杆菌（Bacillussp.）、假单胞菌（Pseudomonassp.）等微生态制剂被应用于水产养殖的病害防治中，但针对某种特定的鱼类和病原体的微生态制剂的研究几乎未见报导。本文试图从自罗非鱼养殖水体中分离得到的具有净化水质功能的微生物菌株中筛选出对罗非鱼链球菌病原——海豚链球菌具拮抗功能的菌株，并从生长优势、共凝集、净化水质的能力等方面进一步筛选得到最适的拮抗菌株，以期为罗非鱼链球菌病的生态防控提供有效方法和适宜菌株，为罗非鱼的健康养殖提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芽孢杆菌（Bacillussp.）、乳杆菌（Lactobacillussp.）、假单胞菌（Pseudomonassp.）、假丝酵母（Candidasp.）、诺卡氏菌（Nocardiasp.）等由中国水产科学院淡水渔业研究中心环境保护研究室分离鉴定并提供；海豚链球菌（Streptococcus iniae）由广西壮族自治区水产科学研究院保存并提供。

1.2 试剂及仪器

试剂：蛋白酶K（≥250 µg/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 µg/mg）、Tris-Hcl缓冲液、革兰氏染液，由上海生工生物工程有限公司生产；硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碘化钾、氢氧化钾、硫酸镁、碳酸钙、硫酸锌、硫酸铁、酒石酸钾钠、二氯化汞、4-氨基苯磺酰胺、N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐，均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；丙酮、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚，均为分析纯，由上海联试化工试剂有限公司生产；BS培养基、MRS培养基、PDA培养基、BHI培养基，由北京陆桥生物技术有限公司生产。

仪器：0.02 mm游标卡尺、PHS-3TC PH酸度计、Eppendorf移液枪、AL 204电子分析天平、Sigma 2-16K台式高速冷冻离心机、Agilent 7530型紫外分光光度计、Nikon 90i光学显微镜、ELx808酶标仪、SANYO MIR-153型高低温恒温培养箱、ZHWY200B恒温振荡摇床、TOMY Autoclave SS-325型全自动高压灭菌器、ZHJH-1214双面气流式无菌工作台、一次性细菌微孔滤膜器（膜孔径为0.22 µm），一次性灭菌注射器（2 mL、5 mL），打孔器等。

培养基：芽胞肝菌、假单胞肝菌采用BS培养基；乳杆菌采用MRS培养基；假丝酵母、诺卡氏菌采用PDA培养基；海豚链球菌采用BHI培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的活化和纯化 在紫外无菌操作台从 4℃冷藏保存的菌种斜面上取一环菌苔，接种于 50 mL灭菌的液体培养基中，于28℃恒温振荡培养24 h，取菌液在含固体培养基的平板上划线，置平板于恒温28℃培养箱内培养48 h。从平板上挑取单菌落，进行革兰氏染色镜检，合格后将单菌落接种于灭菌的斜面固体培养基上，经培养后于4℃冰箱保存备用。

1.3.2 拮抗海豚链球菌的功能微生物筛选 参照Tramer等[4]的抑菌圈方法进行。采用BHI液体培养基培养海豚链球菌，28℃培养24 h，吸取0.1 mL培养液于无菌平皿中，待经115℃灭菌的BHI固体培养基冷却至40℃左右后，倒入平板，与菌液混匀后放置于无菌室约1 h，取出并倒置放于4℃冰箱中1 h。用打孔法（用直径0.40 cm打孔器在平板表面均匀打孔，然后按照每孔15 µL的加样量加入经过滤除菌的待测菌株培养液）将待测菌株的过滤除菌滤液引入平板，每一个处理3个重复，28℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小，计算平均抑菌圈直径。

1.3.3 拮抗海豚链球菌的功能微生物的复筛

1.3.3.1 菌株生长曲线的测定 参照Niall等[5]的方法进行。待测菌株培养20 h后用0.85%的无菌生理盐水调至菌浓度约为107 cfu/mL，取10 µL菌液分别加入含250 µL液体培养基的酶标板各孔中，每个样品做3个平行，以10 µL无菌生理盐水代替菌液为对照。将96孔板置28 ℃培养箱中培养，每隔30 min用酶标仪测定各孔OD630值，连续测定24 h。根据OD630值绘制生长曲线，然后选取生长曲线上最陡的8个点做生长曲线拟合度直线，直线斜率即为最大生长率（µ），直线在X轴上的截距为延滞期（λ），生长曲线稳定期切线在Y轴上的截距为最大生物量（A）。根据公式t=ln2/µ求得倍增时间(t)，根据公式RI=1/(λ×td)求得各菌株的生长系数（RI）。

1.3.3.2 共凝集试验 参照Chabrillon等[6]方法并稍作修改进行。于肉汤液体培养基中接种海豚链球菌和上述初筛的拮抗菌株，28℃过夜培养，测定其OD630值，并将其OD630值稀释至0.5，然后各取海豚链球菌和拮抗菌株1.5 mL于无菌具塞试管中，涡旋振荡混匀，28℃静置培养4 h后测定OD630值。3.0 mL纯培养的海豚链球菌和拮抗菌株28℃静置培养4 h作为对照管。共凝集率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100；式中：SC和LC分别表示对照管海豚链球菌和拮抗菌株的终OD630值，S+L表示试验管终OD630值。

1.3.3.3 不同菌株对水体中两种形式无机氮的利用 取罗非鱼养殖水体，经 121℃灭菌后备用。在上述养殖水体中加入经抽滤除菌的NH4Cl和NaNO2溶液，使水中NH4+-N的浓度为1.0 mg/L、3.5 mg/L和7.0 mg/L；NO2--N的浓度为0.15 mg/L、0.50 mg/L和1.00 mg/L。以养殖水体（初始浓度NH4+-N为0.34 mg/L，NO2--N为0.08 mg/L）为对照，加入经培养24 h后的海豚链球菌菌液，使各组水体中初始菌浓度为1.0×106cfu/mL，于28℃下恒温培养24 h，分析在不同氨氮、亚硝酸盐浓度下海豚链球菌的生长情况。同时，在NH4+-N浓度为7.0 mg/L或NO2--N浓度为1.00 mg/L 、pH值为7.0的灭菌养殖水体中加入所筛选的拮抗功能菌株，初始菌浓度为1.0×106cfu/mL，于28℃下恒温培养，48 h后取样，测定水样中的NH4+-N和NO2--N浓度。试验方法参照吴伟等[7]的方法并稍作修改，NH4+-N和NO2--N分别采用纳氏试剂法、重氮-偶氮分光光度法[8]。试验设3个平行。

1.4 数据分析

试验数据采用SAS软件进行差异显著性检验，显著度水平α为0.05。

2 结果与分析

2.1 菌种的活化培养和纯化

将从罗非鱼养殖水体中分离所得的具净水功能的微生物菌株进行活化和纯化，获纯菌株57株，分别标记为：B0901～B0918（芽孢杆菌））、L0901～L0920（乳杆菌）、C0901～C0910（假丝酵母）、N0901～N0906（诺卡氏菌）、P0901～P0903（假单胞菌）。

2.2 拮抗海豚链球菌的功能微生物筛选

采用打孔法对从水中分离的具有净化水质功能的微生物菌株进行筛选，共筛选出11株对海豚链球菌具有拮抗作用的菌株，其中B0903、B0910、B0916（芽孢杆菌）、L0914、L0917（乳杆菌）、C0909（假丝酵母）、N0906（诺卡氏菌）7株菌株的拮抗效果比较明显，结果见图1、2。

图1 采用打孔法测定菌株拮抗作用的结果

图2 拮抗功能菌株对海豚链球菌的抑制作用

表1 拮抗菌株与海豚链球菌的生长曲线的参数(a: P<0.05 )

2.3 拮抗海豚链球菌的功能微生物的复筛

2.3.1 生长曲线的测定 对所筛的7株具拮抗功能的菌株和海豚链球菌进行了生长曲线的测定，从中推导得出了相关的生长参数，具体见表1。由表1可知，7株菌株中除L0914外，其余的最大生长量均高于海豚链球菌；7株菌株的最大生长率、生长系数均高于海豚链球菌；B0903、B0910、B0916的延滞生长期时间显著长于海豚链球菌（P<0.05），L0917的延滞生长期显著短于海豚链球菌（P<0.05）；除B0903倍增时间长于海豚链球菌外，其余 6株均短于海豚链球菌的倍增时间，其中L0917、C0909、N0906的倍增时间显著短于海豚链球菌的倍增时间（P<0.05）。生长系数较大且具有短的延滞生长期和短的倍增时间的菌株具有生长优势，由此可知L0917、C0909 、N0906具有生长优势，且C0909的生长优势最强。

2.3.2 共凝集实验 7株拮抗菌株与海豚链球菌的共凝集效果如图 3所示。只有 L0914、C0909、N0906能与海豚链球菌产生共凝集作用，共凝集率分别为3.03%、4.11%、1.85%。

2.3.3 不同菌株对水体中两种形式的无机氮的利用

2.3.3.1 海豚链球菌对水体中两种形式无机氮的利用 研究结果（图4和图5）显示，NH4+-N、NO2--N浓度对海豚链球菌的生长有一定的影响。NH4+-N浓度为7.0 mg/L的试验组中海豚链球菌的菌量显著高于对照组（P<0.05），NH4+-N浓度为1.0 mg/L的试验组与对照组相比无显著差异（P>0.05），表明一定量的NH4+-N可以为海豚链球菌提供氮源，促进其生长和繁殖；NO2--N浓度为0.50 mg/L、0.15 mg/L的试验组与对照组无显著差异（P>0.05），NO2--N浓度为1.00 mg/L的试验组与对照组相比差异显著（P<0.05），表明过高的NO2--N可对细胞产生较强的毒性作用而引起海豚链球菌生长受到抑制。

图5 养殖水体中的NO2--N对海豚链球菌生长的影响

表2 7株拮抗功能菌株对氨氮、亚硝酸的去除能力

2.3.3.2 7株拮抗菌株对水体中两种形式无机氮的利用 7株拮抗菌株对水体中两种形式无机氮的利用以去除率表示，结果如表2所示。7株菌株对养殖水体中的NH4+-N、NO2--N都具有一定的去除能力。B0916、L0917具有较强的对NH4+-N和NO2--N的综合去除能力，对NH4+-N的去除率分别为57.43%和54.14%，对NO2--N的去除率为61.00%和76.00%。去除NO2--N能力较强的菌株为B0916、L0914、L0917；而去除NH4+-N的能力由强到弱依次为N0906>B0910>B0916> 0917>B0903>L0914>C0909。菌株N0906与B0910在NH4+-N去除率上差异不显著(P>0.05)，而与其它菌株之间差异显著(P<0.05)。根据海豚链球菌对水体中两种形式无机氮的利用试验结果可以看出，NH4+-N浓度较高时，海豚链球菌可以利用铵态氮满足自身的生长和繁殖，因此降低水体NH4+-N的浓度有利于抑制海豚链球菌的快速增殖，B0910和N0906菌株具有较高的NH4+-N的去除率，有利于与海豚链球菌竞争铵态氮资源从而抑制其生长。

3 讨 论

罗非鱼链球菌病的发生主要是鱼体、病原菌和环境三者之间相互复杂作用的结果，其中养殖生态环境的恶化加重了病害的流行与危害程度。据研究报道，大部分鱼类发病池塘的水质很差，氨氮含量超过3 mg/L[1]。环境的恶化可导致鱼体的生长和健康受到损害，抵抗力下降，而这种恶化环境中的主要污染因子（如氨氮、亚硝酸盐）恰恰是病原菌良好的营养源，可促使其大量繁殖，最终导致疾病的大规模爆发。Narad等[9]认为罗非鱼链球菌病的发生与水质理化因子、养殖密度等可引起鱼体应激反应的因素有关。其也与水体中存在的大量链球菌有直接的关联[10]。本项研究选择从分离自罗非鱼养殖水环境中具有净化水质功能的微生物菌株中来筛选拮抗菌株，避免了外源生物的影响，保证了所筛选菌株的生态应用安全性。拮抗菌株的筛选方法主要是基于抑菌活性物质可以在固体或半固体培养基上扩散，从而抑制敏感指示菌的生长，在培养基上形成透明抑菌圈这一机制。目前常见的实验方法有点种法（spot-on-the-lawn）、纸片法（disc-diffusion）、打孔法（well-diffusion）等。本研究采用纸片法和打孔法做了预试验，并对2者的效果进行了比较。当用纸片法吸取同等体积的无菌滤液于直径相同的滤纸圆片中时，滤纸圆片上的滤液向四周扩散的速度和数量可能会不一致，可导致抑菌圈变成椭圆形，不易于菌株拮抗活性大小的比较，故正式研究时采用的是打孔法。另外指示菌浓度也对抑菌圈的边缘整齐程度、清晰度、抑菌圈直径有着影响[11]。研究选用6×107cfu/mL、6×106cfu/mL、6×105cfu/mL 3种指示菌浓度做比较，浓度为6×106cfu/mL时，抑菌圈边缘清晰，易于观察和测量，且抑菌圈值较大。因此后续的试验研究过程中采用的海豚链球菌浓度为6×106cfu/mL。

经打孔法初步筛选获得了11株具拮抗功能的菌株，其中拮抗功能比较强的菌株有7株，分别为3株芽孢杆菌、2株乳酸杆菌、1株是诺卡氏菌和1株假丝酵母。关于芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌作为微生态制剂应用于水产病害生态防治的报道已很多，而放线菌在水产养殖方面的应用甚少，近几年也都只局限于海洋放线菌上[12-13]。Salah等[14]在体外拮抗实验中发现芽孢杆菌对嗜水气单孢菌具有拮抗作用，将其添加到饲料中喂食罗非鱼，鱼体的成活率提高，免疫力增强。Vo Minh Son等[15]用添加乳酸杆菌的饲料喂食斜带石斑鱼，降低了由链球菌引起感染的死亡率，存活率提高了36.7%。Mohsen等[16]将不同量的酿酒酵母菌添加到饲料中喂养尼罗罗非鱼 14周后，采用注射法感染嗜水气单孢菌，10 d后鱼体的死亡率和血清中病原菌的数量随着添加酿酒酵母菌量的增加而降低。

微生态制剂进入复杂的养殖环境后需形成优势种群才能充分发挥其作用，因此微生态制剂必须具有快速的生长优势，以便能够在水环境中迅速繁殖成为优势种群净化水质，并且也能够有更多的机会粘附于鱼类机体。通过产生抑菌物质、营养竞争等途径而发挥抑菌作用。从生长参数来看，C0909的生长最具优势，L09017、N0906的倍增时间显著短于海豚链球菌，延滞期也较短，在一定条件下也可以形成优势菌。

有益微生物与病原菌之间的共凝集被认为是排除病原菌的一种方法。本研究的7株拮抗菌株只有L0914、C0909、N0906与链球菌产生共凝集作用，共凝集率分别为3.03%、4.11%、1.85%，与Chabrillon等[6]的候选菌与病原菌2%左右的共凝集率结果相似，但却明显低于张子华等[17]从鱼体肠道分离的候选菌与病原菌10%以上的共凝集率。这可能是从肠道分离的菌株本身具有分泌粘液粘附于肠道才得以在肠道中生存的本能所导致。共凝集有助于拮抗菌株与链球菌结合在一起后影响链球菌对罗非鱼体表和鳃粘液的粘附作用，从而有效地排除病原菌。

在水产养殖生产中，氨氮、亚硝酸盐是高产养殖池塘中2项极为重要、需引起重点关注的水质因子[18]。水体中的分子态氨、亚硝酸盐对养殖生物而言属有毒因子，它会破坏鱼类及其它水生动物的鳃组织，并渗进血液中，使鱼体抵抗力下降，对病原菌的易感性增强，因此本研究选择氨氮和亚硝酸盐两个指标，研究海豚链球菌和7株拮抗菌株对两种形式无机氮的利用能力。芽孢杆菌、乳酸杆菌、诺卡氏菌，假丝酵母四种菌株净化养殖水质的研究均有报道[19-22]，不同的菌株其净化特性不同，在分解水中有机物、同化水中氨氮、降低亚硝酸盐等方面发挥的作用各异。陈静等[20]研究表明枯草芽孢杆菌B7对氨氮的去除率大于80%，对亚硝酸盐的去除率大于29%，该结果说明枯草芽孢杆菌对氨氮和亚硝酸盐具有一定的转化去除功能。刘慧玲等[23]应用枯草芽孢杆菌净化罗非鱼鱼苗养殖水体的结果显示，枯草芽孢杆菌对氨氮、亚硝酸盐的去除率分别为45.8%、75.9%。丁雷等[24]却发现芽孢杆菌不能起到分解水体中小分子有机物、同化氨氮的作用，但有明显降低亚硝酸盐的作用。陈红菊等[25]研究了光合细菌、芽孢细菌、放线菌对养殖水体中亚硝酸盐含量的影响，其结果表明三种微生物都有净化水质的作用，放线菌的净化效果优于光合细菌和芽孢细菌。本研究中诺卡氏菌N0906去除氨氮的能力最强，去除率为63.31%，乳杆菌L0917具有很强的亚硝酸盐去除能力，去除率为76.31%，虽然乳杆菌L0917在拮抗作用、生长优势、共凝集作用上弱于诺卡氏菌N0906，但在亚硝酸盐去除能力上优于诺卡氏菌N0906。在实际生产应用中，单一使用诺卡氏菌N0906会存在对亚硝酸盐降解不足的缺点，因此可以利用乳杆菌L0917降解亚硝酸盐能力强的特性，与诺卡氏菌N0906菌株相配互补，以进一步增强水体净化的效果。

4 小 结

在罗非鱼养殖水体中分离到多株具有净化水质功能的菌株，通过对这些菌株的初筛，获得了 11株对罗非鱼链球菌病的病原——海豚链球菌具有拮抗功能的微生物菌株。对其中7株拮抗效果较为显著的菌株从生长优势、共凝集率、净化水质能力等3方面进行进一步的筛选，获得一株具综合优势的高效菌株——诺卡氏菌N0906。相对于其它的菌株，诺卡氏菌N0906具有良好的生长优势、可与链球菌产生共凝集作用、具有良好的净化水质功能，故适宜作为罗非鱼养殖中控制养殖生态环境和链球菌病害的微生态菌株。但诺卡氏菌N0906的拮抗机理、生态安全性以及与其它菌株的互补协同等还有待于进一步研究，以便对菌株的应用前景作出科学评价，从而更好地应用于罗非鱼养殖中水质的调控和链球菌病的生态防治。

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