生物转化法产D-阿洛糖的分离纯化

冯再平，沐万孟，江 波，*，张 涛，薛 冬

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；3.太极集团浙江东方制药有限公司，浙江绍兴 312000）

生物转化法产D-阿洛糖的分离纯化

冯再平1，2，沐万孟1，江 波1，*，张 涛1，薛 冬3

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；3.太极集团浙江东方制药有限公司，浙江绍兴 312000）

利用重组菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，将原料D-阿洛酮糖生物转化为具有抑癌效果的稀有糖D-阿洛糖。经液相色谱和串联质谱联用技术（LC-MS/MS）鉴定，反应混合液中25%的D-阿洛酮糖转化成了D-阿洛糖。等电聚焦法测定了重组蛋白的等电点为6.3，并成功运用到产物混合液的去蛋白沉淀中。经过预处理的混合糖液，通过DTFCa2+型离子交换树脂实现了分离纯化。最佳分离条件为：柱温60℃，进样量4mL，流速1mL/min。

D-阿洛糖，生物转化，等电点沉淀，纯化

稀有糖（Rare sugar）是一类重要的碳水化合物，在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。根据国际糖协会（ISRS）定义，已知的己糖和戊糖中，除了葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、核糖和L-阿拉伯糖等7种单糖在自然界大量存在以外，其余20种己糖和9种戊糖都属于在自然界含量极少的稀有糖[1]。稀有糖一般具有低热量、低吸收的特点，如D-塔格糖、D-阿洛酮糖等。D-阿洛糖由于具有广泛的生理功能[2]，特别是具有优异的抑癌作用[3]和辅助癌症放[4]、化疗[5]的作用，而成为稀有糖功能性及生物转化研究中的热点。

D-阿洛糖是D-葡萄糖的C-3位差向异构体，属于稀有糖，可利用化学合成和生物转化法生产。相对于化学法，生物转化法具有反应专一性强、副产物少、污染小等优点。D-阿洛糖的生物转化可以通过两步反应实现[6]：首先由较便宜的D-果糖出发，通过D-塔格糖-3-差向异构酶（D-tagatose-3-epimerase，DTE）家族转化生产D-阿洛酮糖[7]；D-阿洛酮糖再由L-鼠李糖异构酶（L-Rhamnose isomerase，L-RhI）[8]或者核糖-5-磷酸异构酶B（ribose-5-phosphate isomerase，RpiB）[9]等酶类催化酮醛糖异构化反应从而获得D-阿洛糖。生物转化法生产稀有糖时，产物和底物通常以一定平衡比例混合存在于混合液中，因此解决产物分离的问题是稀有糖生产中必须面对的难题。通过Ca2+型阳离子树脂配位交换可实现单糖的分离[10]，D-阿洛酮糖与D-果糖的分离方法已有文献报道[11]，而D-阿洛糖与D-阿洛酮糖的分离尚未见报道。要实现D-阿洛糖在食品、制药等领域的大规模应用，先要解决生物转化法生产得到的混合糖液的分离纯化问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-阿洛糖、D-阿洛酮糖 Sigma公司，（≥95%）；DTF-Ca2+色谱分离树脂 江苏苏青集团；IPG预制胶条 、 水 化 上 样 缓 冲 液 美 国 Bio-Rad 公 司 ；CaCl2、DTT、丙酮、盐酸等试剂 均为分析纯。

Agilent 1260高效液相色谱 Agilent公司；Sugar-PakTM1糖柱、UPLC/ES-QTOF-MS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC色谱仪 Waters公司；HL-2B型数显恒流泵、DBS-100自动部分收集器 上 海 沪 西 分 析 仪 器 厂 ；PowerPac Basic电 泳 设备 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 D-阿洛糖的生物转化[9]RpiB酶因具有广泛的底物特异性，可催化与磷酸糖相类似的单糖底物发生酮醛异构化，而被应用于D-阿洛糖的酶法生产。本实验室构建了可以表达Thermotoga lettingae TMO RpiB酶的重组菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，诱导表达后获得冻干菌体备用。在pH8.0，55℃条件下，适量冻干菌体振荡转化100g/L的D-阿洛酮糖底物24h。

1.2.2 转化产物的LC-MS/MS鉴定 LC-MS/MS检测含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产物混合糖液。色谱条件为：ACQUITY UPLC色谱仪，TSK-gel Amide-80氨基柱，流动相65%乙腈，柱温35℃，流速0.3mL/min，进样量1μL。质谱条件为：电喷雾离子（ESI）源；毛细管电压3.0kV；锥孔电压30V；离子源温度100℃。将D-阿洛糖、D-阿洛酮糖标样及反应产物分别上样，测定分析，对照标样和样品峰的出峰时间及质谱碎片，分析样品成分。

1.2.3 重组酶蛋白等电点测定[12]采用离心配合等电点沉淀的方法除去混合糖液中大量存在的RpiB蛋白，需要先测定重组蛋白的等电点。纯化得到电泳纯度95%以上的重组蛋白，重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中，-20℃沉淀过夜。4℃，12000r/min离心30min，沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中，-20℃放置1h。4℃，12000r/min离心30min，在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀。500μL水化上样缓冲液充分溶解适当量的蛋白粉末。在装有预制胶条的水化盘中加入蛋白水化液，4℃水化过夜后进行等点聚焦电泳、考马斯亮蓝染色。

1.2.4 D-阿洛糖样品预处理 经过生物转化得到的产物混合液，8000r/min离心30min除去菌体。调节溶液pH至等电点后煮沸，保持5min使产物混合液中的酶蛋白变性沉淀，12000r/min离心30min除去溶液中蛋白质。采用阴阳离子色谱法脱盐脱色[11]，得到含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合糖液。

1.2.5 DTF-Ca2+离子交换层析[13]DTF-Ca2+色谱分离树脂的处理再生：180mL树脂装填到长1m，内径1.6cm的带有恒温夹套的层析柱，5%的盐酸溶液冲洗至进出口酸度相同后，浸泡4h，纯水冲洗至中性；10%CaCl2溶液冲洗至流出液pH7.30后，浸泡4h，纯水冲洗树脂至中性。上样一定量的混合糖液，以去离子水作为流动相，分别控制夹套温度为55、60、65℃，进样量为4、8、12mL，流速为0.5、1、2mL/min进行洗脱，部分收集器收集洗脱样品。

1.2.6 收集部分的HPLC检测 HPLC测定各收集部分中D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的浓度[13]，计算分离度。分离度的计算公式为[11]：

式中，tDP为D-阿洛酮糖保留时间，tDA为D-阿洛糖保留时间，为D-阿洛酮糖色谱峰的半峰宽度，为D-阿洛糖半峰宽，以上单位均为min。

2 结果与讨论

2.1 D-阿洛糖产物的定性、定量检测

以含RpiB酶的菌体催化D-阿洛酮糖的生物转化，获得含有D-阿洛糖的产物混合液。对转化产物进行LC-MS-MS定性，对比转化产物和标准品的液相出峰时间及质谱图谱，分析反应产物成分。如图1所示，在（e）产物色谱图中，有两个峰分别与（a）中的D-阿洛糖标样及（c）中的D-阿洛酮糖标样色谱出峰时间 相 对 应 ；且 对 应 时 间 出 峰 处 的 MS-MS 图 谱 ，（f）与（b）中D-阿洛糖标样、（g）与（d）中D-阿洛酮糖标样的MS-MS谱图碎片相一致。因此，可以判定转化产物中确实存在D-阿洛糖、D-阿洛酮糖两种组分，即生物转化法生产D-阿洛糖的产物与底物，且根据色谱定量结果表明，转化产物中两者的比例是25∶75，与其他文献[3]报道的RpiB催化D-阿洛糖生成的酶反应产物平衡比例较为接近。

2.2 等电点测定及产物预处理

重组RpiB等电点的计算值为6.49，而根据IPG预制胶条的线性梯度计算出来的RpiB的等电点为6.3，说明该酶的等电点在中性偏酸的位置。在等电点沉淀去蛋白的时候，以盐酸调节产物混合液的pH至6.3~6.5之间时出现明显混浊，加热处理后出现大量沉淀；与同不调节pH并直接进行加热处理的产物混合液相比，蛋白沉淀增加显著。本转化反应中运用的RpiB酶耐热性较好，转化反应可以在较高温度下进行，提高了转化效率且不易受微生物污染。因此，不同于其他酶高温处理后即可变性沉淀，在产物处理的时候，必须结合等电点沉淀和高温处理，才能达到满意的蛋白去除效果。同时，调节反应产物pH到中性偏酸后再进行加热处理，也可避免单糖在偏碱性环境中加热生成较多的副产物。

2.3 糖液的离子交换树脂分离

2.3.1 温度对分离效果的影响 根据HPLC测定结果，D-阿洛糖先于D-阿洛酮糖洗脱下来。糖液浓度与洗脱体积进行Gause拟合，计算两者的分离度。如图2所 示 ，进 样 量 为 12mL，流 速 为1mL/min，柱 温 为55、60、65℃时，分离度分别为1.01、1.09和1.01，可见60℃时D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分离效果较好，在后续实验中采用此柱温条件。

2.3.2 进样量对分离效果的影响 采用流速1mL/min，柱温60℃的分离条件，考察进样量对分离效果的影响。由图3可知，进样量为4、8、12mL时对应的分离度分别为1.76、1.51和1.13。在固定填料体积的情况下，进样为4mL时的分离效果较好，上样量增加，加大了分离柱的负荷，糖之间的分离度下降。进样体积8mL时，分离效果稍有下降，但是一次进样量提高了1倍，产品量较多而对纯度要求不高时可以考虑使用该条件。

2.3.3 洗脱速率对分离效果的影响 柱温为60℃、进样体积为4mL时，不同洗脱速率下D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分离曲线如图4所示。结果显示，洗脱速率为0.5、1、2mL/min时，分离度分别为1.45、1.76和1.37，1mL/min为最佳洗脱速率，在此条件下可以分离得到纯度90%以上的D-阿洛糖。

图1 生物转化产物的LC-MS-MS图谱Fig.1 LC-MS-MS profile of main products in the reaction mixture

图2 不同柱温时D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分离曲线Fig.2 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different temparatures

3 结论

利用重组菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，以D-阿洛酮糖为底物进行生物转化，LC-MS-MS检测，获得了D-阿洛糖、D-阿洛酮糖两者比例为25∶75的产物混合液。针对重组RpiB耐热性好，仅用高温处理反应液去蛋白效果不理想的情况，本研究通过等电聚焦电泳测得重组酶的等电点为6.3，在此基础上实现了等电点沉淀结合热处理法去除反应液里的蛋白，取得了较好的效果。建立了DTF-Ca2+型离子交换树脂分离D-阿洛糖、D-阿洛酮糖的方法，分离得到了纯度90%以上的D-阿洛糖，为大规模生物转化法产D-阿洛糖提供了技术支持。DTF-Ca2+型离子交换树脂分离D-阿洛糖的具体条件为：填料180mL，带恒温夹套的层析柱长1m，内径1.6cm，去离子水为流动相，进样量为4mL，洗脱速率为1mL/min流速，柱温为60℃。

图3 不同上样体积时D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分离曲线Fig.3 Seperation curve of D-allose and D-psicose with different loading volume

图4 不同洗脱速率时D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分离曲线Fig.4 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different flow rate

[1]Granstrom T B，Takata G，Tokuda M，et al.Izumoring：A novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，97（2）：89-94.

[2]沐万孟，张龙涛，江波，等.D-阿洛糖的功能及生物转化生产研究进展[J]. 安徽农业科学 ，2007，35（32）：10192-10193，10200.

[3]Lim Y R，Oh D K.Microbial metabolism and biotechnological production of D-allose[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（2）：229-235.

[4]Hoshikawa H，Indo K，Mori T，et al.Enhancement of the radiation effects by D-allose in head and neck cancer cells[J]. Cancer Letters，2011，306（1）：60-66.

[5]Yamaguchi F，Kamitori K，Sanada K，et al.Rare sugar D-allose enhances anti-tumor effect of 5-fluorouracil on the human hepatocellular carcinoma cellline HuH-7[J].Journalof Bioscience and Bioengineering，2008，106（3）：248-252.

[6]柏玮，朱玥明，门燕，等.以D-果糖为原料利用新型异构酶转化生产D-阿洛糖[J]. 生物工程学报，2012，28（4）：457-465.

[7]Mu W M，Zhang W L，Feng Y H，et al.Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，94（6）：1461-1467.

[8]Lin C J， Tseng W C，Fang T Y.Characterization of a thermophilic L-rhamnose isomerase from caldicellulosiruptor saccharolyticus atcc 43494[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（16）：8702-8708.

[9]Feng Z P，Mu W M，Jiang B.Characterization of ribose-5-phosphate isomerase converting D-psicose to D-allose from Thermotoga lettingae TMO[J].Biotechnology Letters，2013，35（5）：719-724.

[10]钱永，戴军，彭奇，等.离子交换树脂层析法分离木糖醇结晶母液[J].离子交换与吸附，2005，21（2）：112-120.

[11] 邢庆超，沐万孟，江波，等.D-阿洛酮糖的分离纯化[J]. 食品工业科技，2011，32（9）：236-238.

[12] 郭尧君. 蛋白 质 电 泳 实 验 技 术[M]. 北 京 ：科 学 出 版 社 ，2001：262-283.

[13]赵萌，张涛，沐万孟，等.阳离子交换树脂分离纯化酶法合成 的 双 果 糖 酐 Ⅲ[J]. 食 品 与 发 酵 工 业 ，2009，35（9）：134-136，141.

Separation and purification of D-allose produced by biotransformation

FENG Zai-ping1，2，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHANG Tao1，XUE Dong3
（1.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；3.Taiji Group Zhejiang Dongfang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shaoxing 312000，China）

The anticancer rare sugar D-allose was converted from D-psicose by E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib. The LC-MS/MS results showed that 25%of D-psicose was converted to D-allose in the reaction product mixture.The pI of the recombinant protein was 6.3 determined by isoelectrofocusing and was successfully applied in isoelectric precipitation.The methods of separation and purification of D-allose was established according to DTF-Ca2+cation exchange chromatography with a flow rate of 1mL/min，column temperature at 60℃ and the loading volume of 4mL.

D-allose；biotransformation；isoelectric precipitation；purification

TS202

A

1002-0306（2014）22-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.058

2014－02－27

冯再平（1978-），女，博士研究生，讲师，研究方向：食品生物技术。

* 通讯作者：江波（1962-），男，博士，教授，研究方向：酶在食品生物制造中的应用。

国家自然科学基金项目（21276001，31171705）；绍兴市科技计划项目（2013A23002）。