三种桂产桉叶油对常见致腐菌的抑制作用研究

蓝亮美，马 丽，郭占京，郑燕菲，陈荟芸，刘祖盛

（广西大学化学化工学院，广西南宁 530004）

三种桂产桉叶油对常见致腐菌的抑制作用研究

蓝亮美，马 丽*，郭占京，郑燕菲，陈荟芸，刘祖盛

（广西大学化学化工学院，广西南宁 530004）

采用水蒸气蒸馏法提取柠檬桉、窿缘桉、尾叶桉三种桂产桉叶挥发油，并用GC-MS对三种桉叶挥发油的化学成分进行分析；采用试管二倍稀释法测定了三种挥发油对食品中常见致腐菌（蜡状芽孢杆菌、姜瘟杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黑曲霉）的最小抑菌浓度，并以亚硝酸盐为阳性对照。结果表明：三种桉叶挥发油的化学成分及含量有很大的差异，对供试菌种均有一定的抑制性，尤以柠檬桉叶挥发油的抑菌活性最为突出，有望应用于食品保鲜中。

桉叶油，致腐菌，抑菌活性，食品保鲜

桉 树（Eucalypt）为 桃 金 娘 科（Myrtaceae）桉 属（Eucalyptus）植物，是我国3大造林树种之一[1]。广西是我国桉树主要栽培区[2]。从桉叶中提取得到的桉叶油因其特殊的芳香气味和良好的杀菌消毒作用而格外引人关注。田玉红等[3-5]对广西种植的桉树精油化学成分进行了系统研究，指出桉叶油具有广谱抑菌活性；叶舟[6]指出巨尾桉叶油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性；杨巧丽[7]也指出尾巨桉桉叶油脂对农杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌的有抑菌活性，但对食品中常见的致腐菌还缺乏关注。

微生物引起的食物中毒至今仍威胁着人类的健康，曲霉属微生物是主要的食品污染源，可导致食品发生腐败变质，有些还产生致癌真菌毒素，引起恶性肿瘤，食品保鲜日益受到人们的重视。目前使用的食品保鲜方法多使用化学合成保鲜剂，其安全性受到怀疑。天然、安全的功能性食品保鲜剂的研究开发就显得越来越重要。利用桉叶油的抑菌活性及其特殊的香味开发新型的食品保鲜剂具有重要的意义。本研究利用气相色谱-质谱联用技术分析了挥发油化学成分及含量，测定了柠檬桉（E.citriodora）、隆缘桉（E.exserta）、尾叶桉（E.urophylla）三种桂产桉树叶挥发油对食品中常见致腐菌：蜡状芽孢杆菌、姜瘟杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌和烟曲霉、黑曲霉的最小抑菌浓度，为桉树叶油在食品保鲜方面的开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬桉、隆缘桉、尾叶桉叶 均采自广西大学校园 ；蜡 状 芽 孢 杆 菌（Waxy spore bacteria）、姜 瘟 杆 菌（Jiang wen coli）、痢疾杆菌（Dysentery bacillus）、沙门氏菌（Salmonella） 由广西中医药大学提供；烟曲霉（Aspergillus fumigaTus）、黑曲霉（Aspergillum niger）由广西大学生命科学技术学院提供；细菌采用牛肉膏琼脂培养基，霉菌采用完全培养基[8]。

QP5050A型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；YXQ.SG41 280型手提式高压灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；KQ-600DB型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250B型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；AR224CN型电子天平 OHAUS国际贸易（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桉叶挥发油的提取 将新鲜叶片（已去掉叶柄）剪成1～2cm2的碎片，称取桉叶样品200g置于挥发油提取器中，加入800mL水，按常规水蒸气蒸馏法提取6h[9]，静置使油水清晰分层后取下油层备用。

1.2.2 桉叶挥发油成分的GC-MS分析 桉叶挥发油成分的定性定量分析采用气相色谱-质谱联用技术[3]。

气相色谱条件：DB-1型弹性石英毛细管色谱柱（J&W Scientific，USA），规格为0.25μm×0.25μm×30m；载气为高纯氦气；柱前压47kPa，分流比1∶50，进样口温度250℃，进口温度230℃，根据样品的不同采用如下的升温程序：柠檬桉、窿缘桉叶挥发油成分分析时采用的升温程序：60℃保持1min，升至138℃（3℃/min），再升至170℃（2℃/min），继续升至250℃（8℃/min），于250℃保持5min。

尾叶桉叶挥发油成分分析时采用的升温程序：60℃保持1min，升至138℃（3℃/min，其中78～81℃时升温速率为0.5℃/min），再升至170℃（2℃/min），继续升至250℃（8℃/min），于250℃保持5min。

1.2.3 最小抑菌浓度的测定 将100μL的吐温80定容到50mL作为挥发油的助溶剂[10]，采用试管2倍稀释法[11-14]测定其最小抑菌浓度（MIC），取10支10mL的带塞试管（编号1~10），将1.0mL挥发油溶液（0.2mL挥发油+0.8mL吐温80水）加入装有1.0mL培养基的1号带塞试管中，混合均匀后从中取1.0mL加入2号试管中，将2号试管混合均匀后取1.0mL加入3号试管中，依次进行稀释。另取10支带塞试管（编号I~Ⅺ），往I号试管中加入1.0mL吐温80水，依次进行二倍稀释做空白对照。在上述试管中各加入供试菌菌悬液0.2mL，振荡混匀后置于适宜的温度（细菌在37℃恒温培养24h，霉菌在28℃恒温培养48h）下培养。观察结果，以完全没有菌生长的最低浓度的平均值为该挥发油的最小抑菌浓度MIC，以亚硝酸盐为抑菌实验阳性对照，重复测定3次。根据下列公式计算出各桉叶挥发油溶液的最小抑菌浓度（MIC）：

MIC=C/2n

式中，C为加入挥发油的原始浓度；n为完全没有菌生长的试管编号。

2 结果与分析

2.1 MIC的测定结果

由表1可见，三种桉叶挥发油对各种供试菌的最小抑菌浓度各不相同，其中柠檬桉叶挥发油对各种供试菌均表现出最强的抑菌性，最小抑菌浓度MIC低至0.08061mg/mL，对各种供试菌的抑菌活性大小为：蜡状芽孢杆菌＞姜瘟杆菌＝痢疾杆菌＝烟曲霉＞沙门氏菌＝黑曲霉。窿缘桉叶挥发油对沙门氏菌的抑菌作用最强（MIC＝1.340mg/mL），对实验菌的抑菌活性大小为：沙门氏菌＞蜡状芽孢杆菌＝烟曲霉＞姜瘟杆菌＞痢疾杆菌＝黑曲霉。尾叶桉叶挥发油对沙门氏菌的抑菌作用最强，MIC为0.6746mg/mL，与柠檬桉叶挥发油对沙门氏菌的MIC（MIC＝0.6448mg/mL）相当，对各种供试菌的抑菌活性大小为：沙门氏菌＞蜡状芽孢杆菌＞痢疾杆菌＝烟曲霉＝黑曲霉＞姜瘟杆菌。亚硝酸盐对各种供试菌的MIC均大于1mg/mL，亚硝酸盐对黑曲霉的抑菌活性最弱，MIC为75.00mg/mL。由此可见三种桉叶挥发油对各种供试菌的抑菌活性大小为：柠檬桉＞窿缘桉＝尾叶桉＞亚硝酸盐。

图1 柠檬桉桉叶挥发油成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.citriodora

表1 桉叶挥发油对各种供试菌的最小抑菌浓度（mg/mL）Table 1 The MIC of the volatile oil to tested strains in Eucalyptus（mg/mL）

2.2 三种桉叶挥发油的化学成分分析

按上述气相色谱-质谱条件分别对三种桉叶挥发油样品的化学成分进行分析，得到样品的总离子流色谱图和各峰质谱图（图1~图3）。采用计算机对各峰的质谱图进行NIST标准谱库的检索，根据质谱裂解规律进行核对，参考标准图谱和相关文献确定其化学结构，利用峰面积归一法计算各组分的相对含量，已鉴定的化合物含量占总峰面积大于2.0%，如表2~表4所示。

从柠檬桉叶挥发油样品中鉴定出含量占总峰面积大于2.0%的有6种化合物，占挥发油含量的89%以上 ：其 中 醇 类 物 质 3种 ：桉 树 脑（2.39%）、香 茅 醇（2.45%）和异蒲勒醇（5.26%），占总峰面积的10.1%；醛类物质主要是香茅醛，占总峰面积的39.20%，酯类物质2种：丁酸玫瑰酯（21.04%）和乙酸香茅酯（18.96%），占总峰面积的40.0%。

图2 窿缘桉叶挥发油成分的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.exserta

图3 尾叶桉叶挥发油成分的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.urophylla

从窿缘桉叶挥发油样品中鉴定出含量占总峰面积大于2.0%的有6种化合物，占挥发油含量的80%以上。其中碳氢化合物3种：a-蒎烯（18.06%）、β-蒎烯（8.48%）和3-蒈烯（5.27%），占总峰面积的31.81%；醇类物质3种：桉树脑（38.79%）、松香芹醇（7.07%）和罗勒烯醇（2.42%），占总峰面积的48.28%。

从尾叶桉叶挥发油样品中鉴定出含量占总峰面积大于2.0%的有5种化合物，占挥发油含量的86%以上。其中碳氢化合物主要是反式罗勒烯，占总峰面积的20.31%，醇类物质3种：1，4-桉树脑（47.30%）、松油醇（7.80%）和茨醇（4.08%），占总峰面积的59.18%；酮类物质主要是茉莉酮占总峰面积的7.09%。如图4所示。

表2 柠檬桉叶精油的主要化学成分及相对含量Table 2 The main chemical constituents and relative content of essential oils of leaves from E.citriodora

表3 窿缘桉叶精油的主要化学成分及相对含量Table 3 The main chemical constituents and relative content of essential oils of leaves from E.exserta

表4 尾叶桉叶精油的主要化学成分及相对含量Table 4 The main chemical constituents and relative contentof essential oils of leaves from E.urophylla

据报道[15-18]植物挥发油的抑菌活性与挥发油中的醛类物质、酮类物质、酚类物质及其他一些小分子的 萜 烯 类 物 质 有 关 。 万 素 英 等[19]研 究 证 明 ，各 种 酚类、脂肪酸酯类化合物均对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑制作用。胡林峰等[20]研究表明了植物挥发油中的醇、醛、酮以及酚类化合物具有开发为抑菌活性成分的潜力。战广琴等[21]研究揭示香茅醛的抗霉机理。吕慧[22]研究指出桉树脑、a-蒎烯、罗勒烯具有一定的抑菌效果。吴建挺[23]研究发现香茅醇能引起灰葡萄孢丝形态的畸形、原生质凝结核内含物外溢等现象。本实验中利用GC-MS测得桉叶挥发油中含有较高含量的香茅醛、乙酸香茅酯、桉树脑、罗勒烯、a-蒎烯等活性成分，可见桉叶挥发油对食品中常见致腐菌具有较好的抑菌性与香茅醛、乙酸香茅醛、桉树脑、罗勒烯、a-蒎烯等活性成分有关。

图4 三种桂产桉叶挥发油的主要化学成分Fig.4 The main chemical constituents of essential oils of leaves from three kinds of eucalyptus

3 结论

三种桉叶挥发油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌效果，抑菌活性大小为：柠檬桉＞窿缘桉＝尾叶桉＞亚硝酸盐，其中柠檬桉叶挥发油对实验菌最小抑菌浓度MIC低至0.08061mg/mL。

三种桉叶挥发油的化学成分及含量有明显的差异，柠檬桉叶挥发油中含有较高含量的香茅醛、乙酸香茅酯和丁酸玫瑰酯，占挥发油含量79%以上，且抑菌性最强，说明香茅醛、乙酸香茅酯和丁酸玫瑰酯共同具有较好的抑菌性；窿缘桉叶挥发油中含有较高含量的桉树脑、蒎烯类化合物；尾叶桉叶挥发油中含较高的桉树脑、反式罗勒烯等化合物，说明了植物挥发油的抑菌活性机理是蒎烯类、萜烯类物质等共同作用的结果。

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Study on major components and antimicrobial activities of volatile oil extracted from three kinds of eucalyptus leaves

LAN Liang-mei，MA Li*，GUO Zhan-jing，ZHENG Yan-fei，CHEN Hui-yun，LIU Zu-sheng
（College of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China）

Three kinds of volatile oil were extracted from Eucalyptus lemon ， Eucalyptus exserta ， Eucalyptus urophylla with steam distillation respectively and the components of the oils were analyzed by GC-MS.The antimicrobial effects of the oil against foodborne pathogens were tested using double dilution method and the nitrite was used as positive control substance.The results showed that there were big difference between the chemical composition and content of three kinds of volatile oil.Three kinds of Eucalyptus essential oil had certain inhibition activity on the test bacteria and the antimicrobial activity of lemon eucalyptus essential oil was remarkable.Eucalyptus essential oil had good bacteriostatic effect and had application prospect in food preservation.

essential oil；pathogers；antibacterial activity；food preservation

TS205.9

A

1002-0306（2014）22-0155-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.025

2014－03－14

蓝亮美（1990-），女，大学本科，研究方向：天然产物化学。

* 通讯作者：马丽（1971-），女，高级工程师，研究方向：天然产物化工。

广西区科技攻关项目（桂科攻1099061-2）；广西大学“大学生创新创业训练计划”资助项目（120103）。