合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

张若云, 徐广锐, 潘 聪, 谢莉萍, 王洪钟, 张贵友, 张荣庆

(清华大学 生命科学学院, 北京 100084)

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

张若云, 徐广锐, 潘 聪, 谢莉萍, 王洪钟, 张贵友, 张荣庆

(清华大学 生命科学学院, 北京 100084)

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用, 将它们加入体外培养的细胞中, 可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过 RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp, 编码376个氨基酸, 蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长 1908bp, 开放阅读框长度为 990bp, 编码329个氨基酸, 蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp, 开放阅读框长624bp, 编码207个氨基酸, 预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性, 说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃 6种组织中均有表达, 表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。

诱导多功能干细胞; 转录因子; 克隆; 合浦珠母贝(Pinctada fucata)

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)具有高度的分化潜能, 可以分化为机体所有类型的细胞,在细胞治疗、组织器官移植等临床医学领域具有广泛的潜在用途[1]。诱导的多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)具有与ESC相似的高度分化潜能, 由于它是由成体细胞诱导转化而来, 因此,不仅规避了使用人类胚胎的伦理争议, 也可以使用病人自体细胞, 设计更加个性化的治疗方案。

自从日本学者 Yamanaka领导的课题组先后将4个转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4导入体外培养的小鼠和人的成纤维细胞, 使其去分化, 并转化为iPS 细胞[1-2]后, iPS细胞在全球范围内得到广泛应用。

由于这些转录因子参与维持干细胞的多能性和自我更新的能力, 故而又被称作多能性因子(Pluripotency factors)。多能性因子通常具有3个特点: (1)通常在胚胎发育早期表达量较高, 而在大多数已分化的组织中表达降低; (2)维持干细胞的多能性, 其表达量过高或过低均会引起胚胎干细胞分化; (3)多能性因子可协同作用[3]。

这4种多能因子在iPS细胞中起着至关重要但各不相同的作用。

Oct4在干细胞、早期胚胎细胞和生殖细胞中特异表达, 且主要通过与其他重要的转录因子, 如Sox2和Nanog等, 协同作用调节胚胎干细胞的多能性[4-5]。c-Myc基因的表达与细胞的增殖分化有关, 例如,c-Myc基因的表达量增强可以促进细胞生长恶变,导致肿瘤发生, 而在细胞分化的过程中,c-Myc基因的表达量则会降低[5-6]。Sox2基因在胚胎早期发育中发挥重要作用, 可以作为多能性细胞谱系的一个标志物[5]。在体外,Sox2在未分化的胚胎干细胞(ES cell)、胚胎癌细胞(EC cell)中表达, 且随着细胞的分化, 其表达量降低[7-9]。KLF4同样也在细胞增殖和分化过程中发挥重要作用, 可以通过作用于靶基因p21异位表达, 从而抑制细胞的生长和增殖, 也可在p21缺失的细胞中, 通过下调p53来促进细胞增殖[4]。

本实验室之前的研究证明合浦珠母贝外套膜组织在体外培养时功能与体内外套膜细胞类似, 由此为在细胞水平上研究珍珠质生物矿化提供了新方法[10]。但是合浦珠母贝外套膜细胞体外增殖和传代培养一直是体外细胞系建立与培养的难题[11-13]。此次克隆得到合浦珠母贝中的转录能因子Sox2、KLF4及c-Myc基因,一方面为合浦珠母贝中 iPS细胞研究奠定基石; 另一方面考虑到这几个转录因子在细胞增殖和分化过程中所起的重要作用, 或许也可以为合浦珠母贝建立细胞系提供支持, 为生物矿化研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

合浦珠母贝(Pinctada fucata)采自广西北海市珍珠总公司珍珠养殖场。5′/3′RACE Kit(Clotech公司),EasyPureQuick Gel Extraction Kit(TransGen公司), dNTPs、Reverse Transcriptase M-mLV、各种酶(TaKaRa公司), Trizol 试剂(Invitrogen), DEPC(上海生工), 及IPTG、X-gal(Sigma); 其他试剂为国产分析纯, 各种引物由上海生工合成, DNA测序由华大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据本实验室构建的合浦珠母贝外套膜转录组文库中c-Myc、Sox2及KLF4基因的同源序列片段设计5′RACE和3′RACE引物, 基因克隆所用引物序列见表1。

表1 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA克隆所需引物Tab.1 The primers for cloning cDNA of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

在得到c-Myc、Sox2及KLF4基因5′和3′端序列的基础上设计Full1和Full2两端引物。

RT-PCR所需引物见表2。

1.2.2 总RNA提取

取合浦珠母贝的外套膜组织, 用液氮迅速冷冻后磨碎, 加适量Trizol 试剂(50～100 mg/mL )。总RNA提取步骤如下: 样本中加入200 µL氯仿, 混匀后室温放置3 min, 离心15 min取上清; 重复上述步骤一次;上清加入 500 µL 异丙醇, 混匀静置 10 min, 离心15 min弃上清; 加入 1mL 75%乙醇, 振荡混匀离心5 min; 沉淀室温晾干, 加入40 µL DEPC水溶解, –80℃保存。通过A260/280检验获得的RNA的完整性和浓度。

表2 RT-PCR和Real-Time PCR所需引物Tab.2 The primers for RT-PCR and Real-Time PCR

1.2.3 基因的克隆

5′RACE和 3′RACE按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒进行: 首先以合浦珠母贝外套膜的总 RNA为模板, 合成 5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE- Ready cDNA。然后分别以这两个 cDNA序列为模板, 进行 5′RACE和3′RACE。PCR反应程序参照试剂盒说明书。

根据得到的 5′端和 3′端的两段序列进行全长基因的PCR验证。PCR反应程序: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸3 min, 30个循环; 72℃延伸10 min。

PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳, 切下目的条带, 回收PCR产物。将回收产物与T/A克隆载体pGEM-T easy vector (Promega)连接, 转化大肠杆菌Trans2-Blue Chemically Competent Cell (TransGen)菌株, 通过菌落PCR选取阳性克隆送公司测序。

1.2.4 基因的序列分析

应用ORF Finder查找开放阅读框; 用ProtParam (http: //web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白的分子量和等电点; 应用 SignalP(http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测信号肽; 并且使用 Pfam(http:// pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)预测蛋白保守结构域。应用blast在线工具(http: //web.expasy.org/blast/)比对核苷酸和氨基酸序列的同源性, 使用 MEGA4软件绘制系统进化树。

1.2.5 基因的组织分布

首先采用 TaKaRa公司的 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒, 按照说明书条件操作, 将合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织总RNA反转录合成cDNA模板。然后通过RT-PCR鉴定目的基因在各组织分布情况。

2 结果与分析

2.1 c-Myc、Sox2及KLF4基因的克隆及其序列分析

通过RACE方法克隆获得c-Myc、Sox2及KLF4基因的全长cDNA, genbank登录号分别为KC758857、KC758858和KC758859。

基因c-Myc、Sox2及KLF4的全长cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列、相对分子质量、等电点等信息如表3及图1～图3所示。

2.2 编码蛋白的结构预测分析

表3 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA序列及其编码的蛋白性质Tab.3 Sequences and proteins of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

图1 c-Myc基因全长cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列Fig.1 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of c-Myc gene from Pinctada fucata

通过SignalP、Pfam和SOPMA在线分析得到以下结果。

c-Myc蛋白没有信号肽, 不存在跨膜区。Pfam软件预测该编码蛋白含有一段保守的 HLH(helixloop-lelix domain)结构域, 及 Myc-N 保守区域, 而myc蛋白家族是典型的HLH亮氨酸拉链型转录因子,可以通过与DNA特异位点结合而对转录过程进行调控, 从而调控细胞的增殖和分化。据此分析, 该编码蛋白预测正确并参与转录调控[14-15]。

Sox2蛋白未预测到信号肽, Pfam 预测含有HMG-box(high mobility group box), 它是Sox蛋白的特征保守结构域, 这种高迁移率基团在需要染色质构象发生改变的 DNA相关调控过程中发挥作用,如复制转录和DNA修复等[10,13]。编码蛋白上还含有一段与DNA转录调控有关的Soxp(Sox transcription factor)结构域[16]。推测该编码蛋白参与DNA转录调控。

图2 Sox2基因全长cDNA序列及编码氨基酸序列Fig.2 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of Sox2 gene from Pinctada fucata

KLF4蛋白未预测到信号肽, Pfam预测含有两个zf-H2C2_2(Zinc-finger double domain )结构域, 这是KLF蛋白的特征结构域, 表明编码蛋白与基因的表达调控相关[17-18]。

2.3 c-Myc、Sox2及 KLF4蛋白的同源性分析

利用BLAST软件分析c-Myc、Sox2及KLF4基因编码蛋白的同源性, 并使用 MEGA4软件绘制系统进化树(图4)。

同源性分析结果显示: (1)c-Myc基因编码蛋白与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Myc蛋白同源性最高, 约为 63%。同时, 编码蛋白与弗罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae)、青岛文昌鱼(Branchiostomabelcheri)以及半索动物长吻虫(Saccoglossus kowalevskii)的Myc蛋白也分别有约45%、45%和47%的相似性。(2)在分类学上, 合浦珠母贝与太平洋牡蛎同为软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia), 文昌鱼与长吻虫同属脊索动物门(Chordata)。在c-Myc基因的保守性上, 合浦珠母贝与太平洋牡蛎保同源性更高,而与文昌鱼和柱头虫的同源性较低。(3)Sox2基因编码蛋白与太平洋牡蛎(C. gigas) 、池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii) 的 Sox2蛋白以及欧洲冒贝(Patella vulgata) 的uSoxB蛋白分别有约67%、68%和72%的相似性。池蝶蚌也属双壳纲, 冒贝属腹足纲(Gastropoda)。这3种生物与合浦珠母贝亲缘关系都比较近,同源性比对结果也相近。(4)KLF4基因编码蛋白与紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)的 KLF4蛋白、长吻虫(S. kowalevskii)的类KLF2转录因子和拟正海胆(Paracentrotus lividus)的KLF2/4蛋白分别有约 96%、96%和 95%的相似性, 另外与太平洋牡蛎C. gigas的KLF1蛋白同源性约为67%。(5)拟正海胆属棘皮动物门(Echinodermata), 编码KLF4蛋白与海胆中同一亚型蛋白同源性更高, 96%的同源性表明KLF4基因在不同物种中具有高度的保守型。与牡蛎中KLF1蛋白的同源性较低, 可能是由于这两个蛋白亚型自身的差异所致。(6)同源性比对结果显示合浦珠母贝中的这 3个基因与太平洋牡蛎同源性最高,事实上牡蛎与珍珠贝同是双壳贝类, 亲缘关系本来就相近, 这里也得到证明。(7)而 3个基因的同源性比对数据显示, KLF4蛋白在不同物种中的同源性最高, 表明KLF4基因在不同物种中更为保守,Sox2的保守性次之,c-Myc基因相对最不保守。

图3 KLF4基因全长cDNA序列及编码氨基酸序列Fig.3 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of KLF4 gene from Pinctada fucata

图4 c-Myc(a)、Sox2(b)和KLF4(c)基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of c-Myc (a), Sox2 (b) and KLF4 (c) gene

2.4 c-Myc、Sox2及KLF4在合浦珠母贝各组织中分布

与预期相符,c-Myc、Sox2和KLF4是3个非常保守的转录因子, 它们在合浦珠母贝的外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃各组织中都有分布。

图5 Sox2、c-Myc和KLF4基因在合浦珠母贝各组织分布Fig.5 Disstribution of Sox2, c-Myc and KLF4 genes in tissues of Pinctada fucata

3 讨论与小结

自2006年Yamanaka[1]研究小组利用转录因子在体外将小鼠体细胞成功诱导成为多能干细胞之后,Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4作为多能因子被深入和广泛的研究。作者在合浦珠母贝外套膜转录组中找到c-Myc、Sox2及KLF4基因的片段, 并通过RACE-PCR技术克隆得到它们的全长序列, 不仅为以后研究合浦珠母贝中 ips 细胞奠定基础, 或许还可为生物矿化的研究提供新的切入点。

生物信息学分析预测到 c-Myc编码蛋白的一段HLH功能域, 以及 Myc-N保守性片段, 这些都是c-Myc基因编码蛋白的典型特征, 可以通过与 DNA特异位点结合而对转录过程进行调控, 从而起到调控细胞增殖和分化的功能。此前已有较多文章报道过c-Myc蛋白在转录调控中所起的重要作用[14-15]。

而Sox2基因编码蛋白结构中预测到 HMG-box和Soxp结构域, 正如前文所述, HMG-box存在于高迁移率的基团中, 因为这种特性参与到需要改变染色质构象的一系列DNA相关调控过程中[13]。而Soxp结构域作为转录因子参与DNA转录调控[16], 说明合浦珠母贝中Sox2编码蛋白也极有可能参与DNA转录调控过程中。

KLF4编码蛋白中含有两个与基因表达调控有关的锌指双域。因此, 这3个转录因子在合浦珠母贝中同样在DNA水平起着调控基因表达的作用, 对它们的研究具有重要的意义。

在于其他已知基因的同源性比对中, 作者发现在与合浦珠母贝相近的物种尤其是牡蛎中都找到与这 3种基因编码的氨基酸残基序列具有较高相似性的蛋白, 表明它们在遗传进化上具有更近的关系。而合浦珠母贝中预测的这3种蛋白都在N端序列与其他已知蛋白有较大差异, 因此根据这一点可以猜想它们功能上的差异, 可以有针对性的进一步研究。而诸如牡蛎等其他生物中相关蛋白的研究[19-21]也可为合浦珠母贝中这几个转录因子的研究提供重要参考价值。

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(本文编辑: 梁德海)

Cloning and sequence analysis of iPS related transcription factors fromPinctada fucata

ZHANG Ruo-yun, XU Guang-rui, PAN Cong, XIE Li-ping, WANG Hong-zhong, ZHANG Gui-you, ZHANG Rong-qing
(School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Jan., 22, 2014

ips cells; transcription factors; cloning;Pinctada fucata

The four transcription factors namedSox2,Oct4,c-MycandKLF4can reprogram differentiated in vitro culture cells to an embryonic-like state, in another name, ips cells. The complete gene sequence ofc-Myc,Sox2andKLF4fromPinctada fucatawas amplified by RACE PCR. The complete sequence ofc-Mycgene was 1585 bp and the complete ORF length was 1131 bp which encoded a protein with 376 amino acid residues. The analysis of protein structure showed c-Myc protein had the conservative HLH and Myc-N domains, which have the DNA-binding function.Sox2gene has the complete sequence of 1908 bp and the complete ORF length of 990 bp which encoded a protein with 329 amino acid residues. And the Sox2 protein had the conservative HMG-box and Soxp domains, which have the DNA-regulation function.KLF4gene was 2268 bp long and the complete ORF length was 624 bp which encoded a protein with 207 amino acid residues. And the KLF4 protein had two zf-H2C2_2 domains, which have the DNA-binding function. Blast analysis indicated the three deduced amino acid sequences of the c-Myc, Sox2 and KLF4 genes fromP. fucatashowed high homology with proteins fromCrassostrea gigas. RT-PCR result shows that these three genes were expressed in all six tissues fromP. fucataincluding mantle, foot, gonal, visceral mass, adductor muscle and gill, suggesting that these genes were conservative transcriptional factors. Our study inspires the work on cell culture and research inP. fucata.

S823.3

A

1000-3096(2014)04-0007-08

10.11759/hykx20130922001

2014-01-22;

2014-05-12

国家重点基础研究发展计划项目(2010CB126405)

张若云(1987-), 女, 江苏徐州人, 硕士, 主要从事生物矿化研究, E-mail: zhangry61@ 126.com