紧密连接蛋白Claudin-1与变应性鼻炎发病机制相关性初探

黄朝平 张建辉 朱力 唐嗣泉

·临床研究·

紧密连接蛋白Claudin-1与变应性鼻炎发病机制相关性初探

黄朝平 张建辉 朱力 唐嗣泉

目的 研究紧密连接蛋白Claudin-1在变应性鼻炎(AR)患者鼻黏膜中的表达，初步探讨Claudin-1在AR发病机制中的作用。方法 选取AR患者32例作为实验组，同时以22例单纯鼻中隔偏曲患者作为对照组。取患者下鼻甲黏膜，行苏木素-伊红(HE)染色，检测鼻黏膜嗜酸性粒细胞(Eos)浸润数量；采用免疫组织化学法检测Claudin-1的表达，比较2组间Claudin-1的表达强度；对2组病例中黏膜Eos数量与鼻黏膜Claudin-1的表达强度进行相关性分析。结果 实验组鼻黏膜Eos计数(11.52±3.60)显著高于对照组(1.68±1.36)，2组差异有统计学意义(P<0.05)。Claudin-1在下鼻甲黏膜的阳性表达物质呈棕黄色、细颗粒状，定位于黏膜、腺体上皮的细胞膜和细胞质。实验组鼻黏膜中Claudin-1的阳性率(25.00%)较对照组低(81.82%)，2组差异有统计学意义(P<0.05)。Claudin-1的表达强度与鼻黏膜Eos数量呈负相关(r=-0.865，P<0.05)。结论 Claudin-1在AR患者鼻黏膜中的阳性表达率明显下降，提示其表达下降在AR的发病机制中可能发挥重要的作用。(中国眼耳鼻喉科杂志，2014，14：283-286)

变应性鼻炎； 鼻黏膜； Claudin-1； 嗜酸性粒细胞； 免疫组织化学

黄朝平、张建辉为共同第一作者

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)发病率高达10%～25%[1]，其发病机制复杂，目前尚不完全清楚。鼻黏膜紧密连接(tight junction，TJ)蛋白是其功能的主要承担者。TJ蛋白Claudin-1在肿瘤、急性损伤等方面的研究已有报道，但其与AR发病机制的相关性研究较少。因此我们以AR患者为研究对象，检测Claudin-1在AR鼻黏膜上皮的表达情况，并分析Claudin-1的表达强度与鼻黏膜嗜酸性粒细胞(eosinophile, Eos)计数的相关性，初步探讨Claudin-1在AR发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料 所有病例及标本来源于本科2010年5月～2012年12月期间接受鼻内镜手术治疗的住院患者，其中32例AR患者作为实验组、22例单纯鼻中隔偏曲患者作为对照组。AR患者入选标准：①诊断标准参照文献[2]；②标本采集对象为AR合并鼻中隔偏曲行鼻内镜下鼻中隔矫正术的患者，取其下鼻甲黏膜作为实验标本；③手术前2周停止全身和鼻腔局部用糖皮质激素及抗组胺等抗过敏药物。排除标准：①术前6个月内曾经接受免疫治疗者；②孕妇或哺乳期妇女；③合并阿司匹林三联征、严重的全身性疾病、免疫功能缺陷、自身免疫性疾病或者其他可能影响结果判断的患者；④年龄>70岁或<14岁,无法配合完成问卷调查者。符合标准的实验组患者中，男性18例、女性14例；年龄16～58岁，平均35.3岁；病程1～23年，平均6.2年。具有鼻痒、连续性打喷嚏、流大量清涕、鼻塞、鼻黏膜水肿等典型症状和体征。变应原皮肤点刺试验阳性，主要以尘螨、屋尘螨为主。对照组为单纯鼻中隔偏曲患者，其中男性12例、女性10例；年龄19～54岁，平均32.4岁。全部切取代偿性肥大的一侧下鼻甲黏膜作为实验标本。本课题经本院伦理委员会审定同意，所有患者在术前签署了研究知情同意书。

试剂：兔抗人Claudin-1多克隆抗体(一抗)，山羊抗兔IgG(二抗)，辣根过氧化物酶结合物，二氨基联苯胺显色试剂盒，均购自上海生物工程股份有限公司。

1.2 方法 所有新鲜下鼻甲黏膜标本用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，垂直黏膜上皮切成4 μm厚的连续切片，每组标本均行常规苏木素-伊红(haematoxytin-eosin, HE)染色，同时按照免疫组织化学说明书进行。抗原修复采用高压加热法，均设阴性对照。

HE染色于高倍镜(×400)下计数5个视野Eos后取平均值[3]。Clandin-1的阳性表达以鼻黏膜及腺体上皮的细胞膜和细胞质呈棕黄色、细颗粒状为判定标准。根据细胞膜和(或)细胞质的染色程度及染色细胞百分率进行分析评分:基本不着色为0分；着色淡为1分；着色适中为2分；着色深为3分。另外，每张切片400倍视野下随机选择不重复的5个视野，每个视野计数100个上皮细胞，计算其中着色细胞的百分率。着色细胞占计数细胞百分率<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。将每张切片细胞着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，总分0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，6分以上为强阳性(+++)。+为低表达即阴性表达，++与+++为高表达，即阳性表达。

1.3 统计学处理 各组所得结果以均数±标准差表示，采用SPSS17.0软件对免疫组织化学结果作χ2检验，均取检验水准为P=0.05，两因素间的相关性采用直线线性相关分析，当P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 AR患者鼻黏膜组织水肿，上皮部分脱落，伴杯状细胞增生，固有层血管扩张充血，可见散在红细胞，腺体增生，组织间可见较多炎性细胞(包括Eos、淋巴细胞等)浸润，其中以Eos为甚(图1)。对照组鼻黏膜上皮相对完整，腺体无明显增生。高倍镜(×400)下计数Eos，AR组Eos浸润明显(11.52±3.60)，显著高于对照组(1.68±1.36)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组织化学 Claudin-1在AR患者及鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜中阳性表达(呈棕黄色、细颗粒状)于黏膜上皮、腺体上皮的细胞膜和细胞质。AR患者下鼻甲黏膜上皮、腺体细胞可见少量或者无Claudin-1表达(图2)，而对照组下鼻甲黏膜中Claudin-1阳性表达强度明显增高(图3)，2组的阴性对照组均未见棕黄色，呈阴性表达(图4)。AR组及对照组下鼻甲黏膜中Claudin-1表达差异比较(表1)，结果表明Claudin-1在AR患者下鼻甲黏膜中的阳性表达率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1. AR下鼻甲黏膜 HE×200

图2. AR组下鼻甲黏膜 Claudin-1 ×200

图3. 对照组下鼻甲黏膜 Claudin-1 ×200

图4. 对照组 Claudin-1 ×200

组别 nClaudin⁃1阳性Claudin⁃1阴性Claudin⁃1阳性率(%)实验组3282425．00a对照组2218481．82合计54262848．15

注：a示与对照组比较，2组Claudin-1表达阳性率差异有统计学意义(χ2=16.86，P<0.05)

2.3 相关性分析 将Claudin-1的表达强度与鼻黏膜Eos计数进行直线线性相关检验，提示Claudin-1的表达量与鼻黏膜Eos含量成负相关(r=-0.865，P<0.05)。

3 讨论

目前关于AR发病机制的研究已经成为国际上鼻科学的热点，研究的方向呈现“百花齐放”之态势。归纳起来，主要集中在以下方面：细胞因子的改变[4]；Th1/Th2细胞比例失衡[5]；炎性细胞的浸润[6]；卫生学说的进一步研究[7-8]；以及遗传即相关基因的研究[9]等，而对于鼻黏膜上皮细胞(nasal epithelial cells，NECs)在AR发病机制中所扮演的重要角色却研究较少。由于NECs的完整性对于特异性抗原的进入具有决定性作用，因此，观察NECs在AR发病时的形态及其成分的改变有助于从源头认识AR的发病机制，从而有望从另外一个角度提出AR的治疗思路。

NECs作为机体的第一道屏障及固有免疫系统，其主要功能为阻止异物、外界微生物及各种变应原进入到黏膜下层。Sakakura等[10]已经研究证明了正常情况下一般的抗原物质如粉尘螨Ⅰ类抗原(Der p1)等是通过细胞间隙穿过黏膜上皮的。我们推测，如果Der p1等变应原物质对细胞间质蛋白(即TJ蛋白)有直接的水解作用,那么TJ蛋白在NECs的含量或者分布就可能存在变化。当AR发病时，NECs的TJ蛋白可能出现断裂，由此TJ蛋白(包括Claudin、Occludin及ZO-1、ZO-2等)的表达可能出现下调。

鼻黏膜上皮间的TJ蛋白对其功能的维持有重要作用。TJ蛋白存在于上皮细胞间，长度50～400 nm。由于它的存在，相邻细胞之间的质膜紧密结合，没有缝隙，甚至连水分子都不能透过。Furuse等[11]最早发现Claudin家族，目前已发现24种Claudin家族成员，它们具有相似的结构。Claudin家族中各成员间细胞外大环上的氨基酸位置和所带电荷都有很大差异，由此成为区分它们的标志之一[12]，其对于细胞间的渗透性以及紧密连接带的形成具有重要的作用。而位于细胞内部的C末端长度是固定的，但其序列的不同是区分Claudin各成员的另外一个特征。目前已公认，Claudin家族是TJ蛋白中最为重要的一组蛋白,其对维持紧密连接的渗透性起着至关重要的作用[13]，而其中又以Claudin-1研究较多，作用相对更重要，因此我们选择Claudin-1作为观察指标。

有学者[14]通过对下呼吸道的研究表明，呼吸道上皮细胞脱落可能使得黏膜内感觉神经暴露，从而导致黏膜处于高敏状态，这从另外一个角度说明了呼吸道黏膜上皮的完整性对于其功能的发挥具有重要意义。Runswick等[15]在研究AR时证实，花粉蛋白酶直接或者间接地破坏鼻黏膜上皮TJ蛋白，而这被认为可能是促进变应原进入上皮的机制。Vinhas等[16]进行类似研究时发现，花粉含有高相对分子质量的蛋白酶，它们通过破坏Occludin、Claudin-1 和E-黏附分子而增加了Claudin-3跨上皮渗透的能力。这些研究都表明鼻黏膜上皮TJ蛋白的破坏可能是AR发病的第一步。

本研究采用AR患者作为实验组，单纯鼻中隔偏曲患者作为对照组，取其下鼻甲黏膜组织进行研究，首先对2组鼻黏膜组织Eos计数显示，AR组下鼻甲黏膜可见大量Eos浸润，而对照组仅见少量炎性细胞，几乎无Eos。这个结论与之前其他学者[3]的研究基本一致。

我们以免疫组织化学的方法分别观察了AR及单纯鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜中Claudin-1蛋白的表达水平，结果显示：Claudin-1在两者下鼻甲黏膜中阳性表达于黏膜上皮、腺体上皮的细胞膜和细胞质，呈棕黄色、细颗粒状。AR患者鼻黏膜中Claudin-1阳性表达率明显较低，而对照组中鼻黏膜中Claudin-1阳性表达率明显偏高，2组间的Claudin-1阳性表达率差异具有统计学意义(P<0.05)，提示鼻黏膜上皮TJ蛋白Claudin-1的破坏缺失可能对AR的发病起较为关键的作用。将Claudin-1在鼻黏膜的表达水平与鼻黏膜HE染色Eos计数进行相关性分析，结果显示鼻黏膜Claudin-1的表达水平与鼻黏膜Eos计数存在显著负相关。我们推测，外界变应原通过酶解鼻黏膜上皮TJ蛋白，造成细胞间隙过大，变应原进入黏膜下层，引发变态反应，导致鼻黏膜Eos活化和浸润，并造成Th1/Th2细胞失衡，引起Th2细胞产生白细胞介素4(interleukin-4, IL-4)、IL-5、IL-13等细胞因子，而这些细胞因子又刺激Eos的发育、活化及浸润，由此形成恶性循环，引发鼻痒、连续性打喷嚏、流清涕等临床症状。

关于上皮细胞损伤是组织重塑的重要表现之一，目前已无异议，而AR鼻黏膜组织重塑的主要表现为黏膜纤毛上皮损伤、杯状细胞增生等[17]，通过HE染色发现，AR患者鼻黏膜普遍存在上皮脱落、腺体增生等病理表现。在我们研究的AR组中，同时发现鼻黏膜上皮脱落和Claudin-1表达下降的现象，与之前的研究结果基本一致。

TJ蛋白Claudin-1在AR患者鼻黏膜中表达降低，并可能促进Eos的活化、浸润，Claudin-1在鼻黏膜上皮中表达下降可能在AR发病过程中发挥较为重要的作用，但其具体机制尚待进一步研究。

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(本文编辑 杨美琴)

Correlation of Claudin-1 and nosogenesis in allergic rhinitis

HUANGChao-ping,ZHANGJian-hui,ZHULi,TANGSi-quan.

DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,theAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China

Corresponding author： ZHU Li，Email：1968403299@qq.com

Objective To investigate the expression of Claudin-1 in allergic rhinitis(AR) and the role of Claudin-1 in the pathogenesis of AR. Methods Thirty-two AR patients were recruited as the experimental group and 22 cases with deflection of nasal septum (DNS) as the control group. Specimens of inferior turbinate were fixed by 4% formaldehyde. The number of eosinophils(Eos) was measured by haematoxylin-eosin staining. The expression of Claudin-1 was detected by immunohistochemical staining. The results were compared between the two groups. Correlation of Eos content and the expression intensity of Claudin-1 in nasal mucosa was analyzed. Results Eos counts of the specimens in AR group(11.52±3.60) were higher than those in the control group(1.68±1.36) (P<0.05). The positive findings of Claudin-1 by immunohistochemical analysis in the two groups were found in the cytoplasm of the mucosal epithelial cells and glandular cells(brownish yellow,fine granular). The positive rate of Claudin-1 in AR group(25.00%) was significantly lower than that in the DNS group (81.82%) (P<0.05). There was negative correlation between the positive rate of Claudin-1 and the Eos count in nasal mucosa(r=-0.865，P<0.05). Conclusions The tight junction protein Claudin-1 was expressed in the cytoplasm of the mucosal epithelial cells and glandular cells. The down-regulation of Claudin-1 in nasal muscosa imply that it may play an important role in the pathogenesis of AR. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:283-286)

Allergic rhinitis; Nasal mucosa; Claudin-1; Eosinophils; Immunohistochemistry

川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科 南充 637000

朱力(Email：1968403299@qq.com)

现工作单位：成都医学院第一附属医院耳鼻喉科 成都 610599

2013-09-16)