木耳干耳片组织分离的新方法研究*

李 晓 孟秀秀 陈卫卫 李 鹏 孙贺男 任洋洋 高 伟



木耳干耳片组织分离的新方法研究*

李 晓 孟秀秀 陈卫卫 李 鹏 孙贺男 任洋洋 高 伟

（食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118）

木耳；组织分离；干耳片

黑木耳子实体新鲜时半透明胶质，富有弹性，呈耳状、叶片状或不规则形；干燥后收缩成革质，较薄，有一定韧性[1]。菌种生产时不易进行组织分离。传统组织分离方法多以新耳，或用水泡开的干耳作为材料[2]。操作方法繁琐而又极易污染，且多使用氯化汞试剂，不仅对环境造成污染，对木耳也有一定的不良影响。我们通过实践，摸索出两种以干耳片为组织分离材料的实用、有效方法，在一定程度上弥补了上述缺点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）木耳。黑木耳单片品种吉Au01，选取较平整、边缘褶皱、少筋的干耳片作为分离材料。耳片采取自然阴干、晒干，或于35 ℃以下烘干。

（2）烟雾熏蒸气雾消毒剂。选用小袋装的粉末状烟雾熏蒸气雾消毒剂，每小袋约8 g，每次用一袋。

（3）罐头瓶。选择大口玻璃制罐头瓶，瓶体无破损。

（4）培养基。采用PDA斜面培养基：马铃薯（去皮，无芽）200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15～18 g（或琼脂条20 g），水1 000 mL。培养基在121 ℃下灭菌30 min后，待温度降至55～60 ℃时出锅摆斜面备用。

1.2 组织分离方法

（1）熏干耳片组织分离方法。先将选取的耳片用回形针固定在两层塑料膜中央，再将第三层塑料膜覆盖在前两层塑料膜的外侧。将烟雾熏蒸气雾消毒剂点燃后迅速放入大口罐头瓶内，然后将干耳片悬挂于瓶中央，用皮圈将塑料膜固定于瓶口，并封牢。待罐头瓶内无烟后用75％的酒精棉擦拭瓶表，置于已灭菌的超净工作台上。用经75％酒精棉消毒后的手将熏过的干耳片从回形针上取下，固定在回形针的一端，用灼烧灭菌冷却后的镊子夹取远离手持端的不卷曲的耳片，大小如芝麻，放入PDA培养基内，塞上棉塞或硅胶塞，在26 ℃恒温培养箱内培养。以上操作均在超净工作台内的酒精灯火焰附近进行。

（2）熏干耳片泡酒精组织分离方法[3]。在进行组织分离操作前，准备两个培养皿，在超净工作台内向培养皿中加入75％酒精，约为培养皿总体积的1/2。然后再对超净工作台进行紫外线灭菌。

将干耳片按照熏干耳片组织分离方法，移在超净工作台进行。夹取芝麻粒大小的耳片，先放入第一个培养皿中浸泡1 min，然后用镊子夹到第二个培养皿中来回涮2～3次，再用镊子夹着从酒精灯火焰上穿梭（在穿过酒精灯火焰时，木耳组织块会着火，属正常现象）后放入PDA培养基内，塞上试管塞。在26 ℃恒温培养箱内培养。

2 结果与分析

两种木耳组织分离方法的相关试验数据见表1。

表1 木耳组织分离试验结果

分离成功率是指每个耳片分离出纯培养物的几率。表1中数据是分别以一个干耳片为分离材料进行操作所得数据，所以耳片分离的成功率均为100％。

熏干耳片组织分离方法：干木耳块在吸收培养基内水分后膨胀，3～4天萌发；熏干耳片泡酒精组织分离方法，2～3天萌发。说明添加酒精对木耳块的萌发有促进作用。熏干耳片法10支试管培养时有2支试管既不萌发也未污染，这可能是熏蒸时间过长导致的。在培养过程中污染的杂菌，种类较单一，都为细菌。说明以上两种组织分离方法可以有效抑制真菌类杂菌污染。

3 结论与讨论

在熏干耳片组织分离方法的操作中，不可以随意增加烟雾熏蒸气雾消毒剂的用量，否则会熏死木耳，引起分离失败。在熏干耳片泡酒精组织分离方法的操作中，过酒精灯火焰的木耳块着火后应立刻放入培养基内，不可以在外部空间停留过长时间，否则会烧死木耳。此两种方法只适合以干耳片为分离材料。如果操作中用鲜耳或泡开的干耳，在熏蒸过程中会使耳片发黄死亡。由于耳片在晒干过程中会杀死部分杂菌，因此以干耳片为分离材料，可降低耳片本身的杂菌基数。

熏干耳片组织分离方法中，罐头瓶中的耳片不可以碰壁。对罐头瓶用气雾消毒剂熏蒸并封口，可建立一个密闭的无菌环境。所用的烟雾熏蒸气雾消毒剂经济实惠，其有效成分为有机氯，避免了重金属污染。

试验过程污染的杂菌均为细菌。可考虑在分离培养基中加100 μg/mL的青霉素，以减少培养基的细菌污染[4]。

[1] 李玉, 图力古尔. 长白山蘑菇[M]. 北京: 科学出版社, 2003: 77.

[2] 黄毅. 食用菌栽培[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 85.

[3] 杜萍, 崔宝凯. 木耳菌种分离新方法简介[J]. 食用菌, 2009(6): 27-28.

[4] 戴水莲, 林警, 高丽. PDA中加入抗菌素的抗菌作用试验[J]. 食用菌, 2008, 30(1): 28-29.

国家现代农业产业技术体系“北方野生菌收集保育与驯化”（GARS-24）；吉林省重大项目“作物秸秆与畜禽粪便高效转化生产食用菌的关键技术研究与示范”（10ZDGG003）

李晓（1976—），男，副教授，从事食用菌教学、科研和产业化开发等工作。

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2095-0934（2014）03-151-02