线粒体参与糖尿病肾病发生的研究新进展

孙 悦(综述)，甘 华(审校)

(重庆医科大学附属第一医院肾脏内科，重庆 400016)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)为糖尿病累及微血管主要并发症之一，是终末期肾病重要死亡原因。尽管采取多种临床策略治疗糖尿病及防范其并发症，至少1/3患者肾功能仍逐渐降低至终末期。DN的进展性、不可逆性、高发病及高致死率等特点备受研究者关注[1]，研究发现线粒体具备调节细胞增殖或凋亡、维持细胞内钙稳态能力。线粒体可通过加剧炎症浸润、血管纤维化促进糖尿病肾损害：①高糖环境诱导线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)聚集，激活Toll样炎症信号通路；②解偶联蛋白2、线粒体抗病毒信号分子失衡，诱导活性氧类等物质表达；③线粒体钙离子单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)和线粒体钙离子摄取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1，MICU1)异常致线粒体Ca2+生理失稳态。

1 DN与线粒体DNA

真核生物线粒体具有较独立的母系遗传体系。人的mtDNA基因组长16 569 bp，编码37种蛋白，其中13种蛋白是呼吸链的主力军。其DNA呈双环结构，具非甲基化CpG模体，类似原核质粒[2]。故此机体免疫系统会“错认”，mtDNA CpG结构为外来致病因素，从而激发炎性介质释放。Barbalat等[3]和Sparwasser等[4]先后发现mtDNA可直接通过Toll样受体9致炎。注射了氧化mtDNA的小鼠会患上关节炎，且检测血中细胞比例情况，免疫细胞的升高以单核细胞为主[5]。肿瘤患者化疗后，外周血mtDNA水平显著增高，同时发现mtDNA可直接激动Toll样受体9，激活中性粒细胞趋化浸润[6]。更为有力的小鼠体内实验证明，心肌细胞胞液中mtDNA积聚，可诱发小鼠心力衰竭，剔除编码溶酶体DnaseⅡ基因(编码Dnase 2a，为溶酶体降解mtDNA的重要成分)或者注射Toll样受体9的选择性激活剂后，干预组小鼠死亡率显著高于对照组；实验者解剖两组小鼠心脏发现，干预组小鼠左心室扩张，镜下观察心肌细胞中CD68+巨噬细胞及淋巴细胞抗原6G细胞浸润程度严重，且Ⅱ型胶原、白细胞介素6、干扰素α等纤维化及炎性因子表达水平显著高于对照组[7]。上述资料显示，线粒体不单纯是供能细胞器，其还具有潜在致炎能力。另有报道，对DN小鼠的肾组织进行染色发现，发生肾损害小鼠肾小管上皮细胞内的线粒体数量多于对照组[8]。Malik等[9]发现,DN患者外周血细胞mtDNA拷贝数水平较正常组、糖尿病非肾病组显著增高，提示线粒体在DN致病机制中扮演重要角色，这可能与病理状态下线粒体受损裂变有关。正常生理活动下，各细胞有相对恒定的线粒体密度，受损的线粒体可通过自噬作用被清除。然而，当机体遭受炎症、缺血缺氧等打击处于应激状态时，活性氧类大量生成，线粒体受损开始发生分裂，造成细胞内大量线粒体积聚。同时，由于mtDNA与活性氧类生成场所相近，导致其相互作用密切，mtDNA突变、裂解增加，通过Toll样受体放大炎症效应[10]。

2 DN与线粒体调节通路

2.1解偶联蛋白2 解偶联蛋白2(uncoupling protein-2，UCP-2)是一类线粒体内膜载体，在人体多处组织表达，如脂肪、胰岛及肾脏。其参与形成内膜两侧质子漏，控制呼吸链质子转运，抑制葡萄糖转换腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，降低胰岛素抵抗。除此之外，UCP-2作为氧化还原保护蛋白，通过降低活性氧类减轻氧化应激损伤。UCP-2与生物体能量代谢密切相关，这一特点决定了其在代谢性疾病，尤其在糖尿病研究中的重要地位。

有文献报道，UCP-2通过抗氧化作用改善高血糖诱导的内皮细胞功能紊乱，延缓糖尿病微血管病变的发生[11]。Qiu等[12]发现，与正常小鼠相比，糖基化终产物受体基因缺陷糖尿病小鼠的肾小球滤过率降低，蛋白尿增多，而UCP-2基因的表达上调，线粒体超氧化物歧化酶生成减少。另外，研究者发现UCP-2基因剔除DN小鼠模型的近曲小管细胞内，线粒体ATP解偶联作用被腺苷酸转运蛋白通路替代，线粒体膜电位降低、超氧化物生成增多，加重了糖尿病肾脏损害，提示UCP-2通路在机体高糖状态下可增加细胞应激耐受力，代偿器官功能[13]。然而，UCP-2高表达又可增加细胞耗氧量，使器官处于慢性相对低氧低能状态，推动肾功能逐步转入失代偿状态，届时加重肾脏损害恶化[14-15]。UCP-2是一把双刃剑，其在DN的中作用需更多的科学实验进一步探索。

2.2线粒体抗病毒信号分子 线粒体抗病毒信号分子又被称为干扰素β启动刺激因子1、人病毒诱导适配蛋白，是一种线粒体调节蛋白。识别受体视黄酸诱导基因蛋白I和黑色素瘤异化相关基因5与病毒特定RNA区域结合后，改变自身构象，暴露C末端的胱冬肽酶募集结构域段与线粒体抗病毒信号蛋白相连接，从而通过核因子κB激酶抑制剂/肿瘤坏死因子受体相关因子家族成员相关的核因子κB活化剂结合激酶1通路途径，激活核因子κB和干扰素调节因子3，诱导生成干扰素I及其他抗病毒分子[16-18]。此机制区别于核内体Toll样受体途径，介导细胞液中抗病毒作用。

糖尿病是内分泌紊乱相关的代谢性疾病，但有文献报道，其与慢性炎症状态、免疫失衡有关。Stene等[19]发现，病毒感染与1型糖尿病发病的相关性，1型糖尿病患者血中病毒抗体水平与病情严重程度呈正比，而使用胰岛细胞高亲和性病毒(如柯萨奇病毒、脑心肌炎病毒)感染小鼠后，胰岛β细胞因自伤免疫机制凋亡，血糖短期内升高，达到糖尿病诊断标准，该实验成功模拟了1型糖尿病临床及病理改变。另有流行病学调查表明，慢性病毒性肝炎患者罹患2型糖尿病的概率明显增高[20]。上述信息提示，病毒感染可参与糖尿病的发生、发展。

既往文献报道，病毒直接感染肾小球上皮细胞，并不会出现相应临床肾炎病理活检样改变。干扰素I虽然能有效抗病毒，但近几年研究发现，病毒相关性免疫激活后大量释放的干扰素I可诱发足细胞凋亡、系膜细胞增殖、蛋白尿增加、肾功能损害加剧，可作为肾损害独立危险因素，而检测糖尿病患者或糖尿病小鼠模型的外周血，均有线粒体抗病毒信号蛋白及干扰素I反应性高表达[21-22]。该现象可能与糖尿病导致免疫力低下、病毒感染率增高有关，在反复感染过程中，加重肾脏损害。

3 MCU和MICU1

迄今为止，已有大量文献证实线粒体功能紊乱可引起慢性微炎症状态、基质降解及血管内皮的纤维化，而发生机制均有Ca2+通道的异常调控的参与[23-24]。目前已将线粒体Ca2+通道的调节异常与多种疾病相互联系，如心肌炎症浸润及心力衰竭越重，线粒体Ca2+水平越高；线粒体Ca2+水平与胰岛β细胞分泌胰岛素程度一致；给予线粒体Ca2+离子通路特异性阻断剂后，细胞活性氧类生成水平下降，核因子κB、白细胞介素10等前炎性介质的释放也随之下调[25]。线粒体Ca2+水平增高，是胞液Ca2+大量涌入引发的结果。而Ca2+细胞外液流动与调控活性氧类生成有关，目前考虑以下几种机制：①Ca2+通过推动三羧酸循环，加快电子在传递链中的交换速度；②Ca2+可激活一氧化氮合酶活性，上调一氧化氮水平，抑制呼吸链中复合体Ⅳ活性，增加活性氧类含量；③Ca2+与心磷脂结合；④活性氧类大量积聚以及细胞钙调节紊乱的出现，加剧细胞坏死，导致机体损伤与修复并行，加重DN血管病变。

DN病理改变主要为慢性进展性微血管硬化，早期为肾小球毛细血管基膜增厚、系膜区基质沉积，出现毛细管襻折叠及融合，阻塞毛细血管；而病情进展到晚期，肾小球逐渐透明样变并硬化形成，其特征性病理改变为结节性肾小球硬化。有文献表明，线粒体Ca2+水平增高与糖尿病所致蛋白尿、微血管纤维化程度呈正比关系，而予以钙通道抑制剂后微量蛋白尿可基本消失，即提出早期使用药物临床干预可减轻甚至逆转糖尿病肾损害[26]。

20世纪60年代，一种单向运输体在小鼠肾细胞内被发现，并被确认为线粒体摄取Ca2+主要环节，该过程并不需要ATP功能，不伴随其他离子或分子共运输，与曾鉴定的亮氨酸拉链“EF”手形结构域跨膜蛋白1、线粒体钠-钙交换体特性不同[27]。Perocchi等[32]新发现的一种与线粒体摄取钙有关的特殊蛋白，符合这种单向运输体特点，将其命名为MICU1，又名CBARA1(calcium binding atopy-related autoantigen 1)，为困扰科学界数十年关于线粒体钙调控的问题提供了重要思路。前期序列分析发现MICU1的N端有单跨膜结构域及两个经典”EF”手形结构,因此其被认为参与线粒体Ca2+摄取及对细胞质钙离子升高缓冲过程，不影响线粒体呼吸过程及膜电位。后期研究提出，MICU1主要起着“看门人”的作用，通过感知线粒体基质中的钙浓度调节MCU活性，控制Ca2+摄取[28]。MCU是MICU1相对应的线粒体钙单运输体，同样参与线粒体Ca2+摄入活动[29]。Chaudhuri等[30]应用电压钳技术，精确测量HEK-293T细胞株细胞内外的钙离子流动，发现MCU基因剔除或使用选择性抑制剂钌红，单向运输通道向线粒体内泵入钙离子的数目明显减少。这两种蛋白相辅相成，共同调控线粒体Ca2+流通。

Perocchi等[32]进一步明确了MICU1及MCU功能对细胞造成的影响，发现MICU1可维持正常环境下细胞内线粒体的钙摄取水平；一旦MICU1失活，线粒体会出现Ca2+超载，生成过量的活性氧类、阻断ATP生成，并激活AMP激酶介导的自噬系统，最终导致细胞死亡。目前已证实，这两个分子之间平衡的破坏将会导致神经元、心脏细胞、肝脏和其他器官受损[30-32]。虽然MCU、MICU1在DN中的研究尚未见报道，但其发生机制与糖尿病发生密切相关。这两种蛋白被测定在体外肾细胞表达、且可影响肾细胞功能，其可通过影响线粒体Ca2+水平促进糖尿病肾损害。

4 小 结

近年来线粒体结构及功能紊乱在DN致病机制中所起的作用备受关注，对其机制的研究也取得了一定进展。本文就相关资料中较新研究成果，如mtDNA致炎、线粒体蛋白通路异常、MCU和MICU1致钙紊乱失衡等方面进行综述。由此可见，线粒体在DN发生、发展过程中起着至关重要的作用。但以上各环节之间的相互联系尚不够紧密，有待进一步实验及探讨。阐明这些机制及其联系可能为早期阻断由线粒体受损引发的炎症过度释放或蛋白异常表达、改善DN预后提供新的临床治疗思路。

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