脂肪干细胞在创伤修复领域的研究进展

张俊磊(综述)，张培华(审校)

(广东医学院附属医院干细胞与细胞治疗中心，广东 湛江 524001)

创伤修复领域涉及皮肤软组织的创面修复、骨与软骨组织损伤的修复、肌腱与韧带、周围神经的损伤修复。近年由于交通事故的急剧增加、老龄化人群骨质疏松以及糖尿病患者难以愈合的创面等问题给临床医师带来了严峻的挑战。随着对脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)研究的深入，以ADSCs作为种子细胞的组织工程学在创伤修复领域的作用受到越来越多的关注。

1 ADSCs及其分子生物学特性

1.1ADSCs的分离与体外扩增 ADSCs是存在于脂肪组织中、中胚层来源的一种成体干细胞，具有向中胚层组织细胞分化的多向分化能力，同时具有旁分泌功能。目前主要是从腹部抽脂术或植皮术腹部废弃的脂肪组织中分离、培养、扩增获得，其不仅获取方便，而且对患者创伤小，细胞易于扩增。ADSCs的质量与多种因素有关，患者年龄、培养环境、脂肪组织类型、手术类型、取材部位、接种密度等都会影响ADSCs的增殖与分化潜能，Schipper等[1]认为，患者的年龄越小，细胞的分化和增殖能力越强。但Aust等[2]认为，ADSCs的衰老与供体的体质量指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，细胞的凋亡率也不相同，Schipper等[1]发现，人前臂脂肪组织中含有更多的ADSCs，而来自腹部浅层脂肪的干细胞更易耐受凋亡刺激。ADSCs在脂肪组织中含量较少，必须通过分离和体外扩增才能获得大量的ADSCs。目前分离ADSCs的方法有两种：胶原酶法和组织块法。关于胶原酶法国内外均有报道，Jiang等[3]在无菌条件下，取18～45岁女性腹部脂肪抽吸术后的脂肪，用D-Hanks稀释液清洗脂肪组织以去除麻醉药及血细胞，用0.1%胶原酶和0.25%胰酶组成的消化液消化脂肪组织，并持续搅拌20 min，然后将脂肪混合物置于含15%胎牛血清的改良培养基中灭活，1500 r/min离心10 min，用含15%胎牛血清的改良培养液重悬，然后以适当密度接种到培养瓶中，并标记为P0代细胞，放入含5%CO2的37 ℃培养箱中，每2日更换培养液，待细胞数目占瓶底约85%时，用0.25%胰酶消化，根据需要选择冻存或按比例传代。无论是胶原酶法还是组织块法，分离得到的ADSCs均为一种混合细胞，虽然在传代过程中ADSCs进一步纯化，但如何更有效地纯化ADSCs，仍是该领域有待研究的问题。

1.2ADSCs的鉴定及表面抗原标志 国际细胞治疗协会间充质干细胞分会[4]认为，人间充质干细胞最少需要符合以下4项：①在标准培养环境下贴壁生长；②可以向脂肪、成骨、软骨分化；③表达CD73、CD90、CD105；④不表达CD14、CD116、CD34、CD45、CD19、CD79、HLA-DR。从脂肪组织中得到的ADSCs基本符合这些条件。与骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell，MSCs)一样，不同培养条件下，ADSCs可分化为不同的中胚层来源的细胞[4]。骨髓分离MSCs的效率很低，而ADSCs在脂肪组织中易于分离，体外扩增效率明显高于MSCs[5]。ADSCs和MSCs都表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、src同源区3和基质细胞抗原1，但ADSCs和MSCs有两个特征性表达分化抗原CD49d和CD106，ADSCs肯定表达CD49d，不表达CD106，而MSCs则正好相反[6]。需要指出的是，目前尚未发现ADSC的特异性细胞标志物。

1.3ADSCs的分化潜能 ADSCs具有多向分化潜能，经诱导培养后，ADSCs可分化为脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、血管内皮以及神经细胞等。ADSCs不仅具有和MSCs一样的分化潜能，而且其克隆率及维持增殖能力要强于MSCs[7]。Aksu等[8]发现，性别可以影响ADSCs的特性，女性浅部脂肪与深部脂肪在成骨分化方面无显著差异，但男性浅部脂肪成骨分化能力要高于自身深部脂肪，且男性浅部和深部脂肪来源ADSCs的分化能力要强于女性。Levi等[9]发现，来源于股骨的ADSCs的成骨分化能力显著强于来自腹部的ADSCs，并伴有骨形态蛋白4及骨形态蛋白受体1B的升高。多种细胞因子可以刺激ADSCs增殖[10-12]，如成纤维生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)通过其受体，鞘氨醇磷酸胆碱通过激活Jun氨基端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)，血小板源性生长因子通过活化JNK，抑瘤素M通过活化细胞外信号调节激酶信号通路(extracellular signal regulated kinase，ERK)、细胞外调节蛋白激酶以及Janus激酶3/信号转导和转录活化因子1通路，促进ADSCs增殖。Zaragosi等[13]发现，阻断丝裂原活化蛋白激酶1(mitogenactivated protein kinase 1，MEK1)可以降低ADSCs的克隆潜能，但并不影响其分化潜能，说明ERK1/2可能参与了FGF-2介导的细胞的自我更新。此外，过表达端粒酶基因的催化亚单位可延长ADSCs的生存时间，其通过自分泌FGF-2维持其在体外的自我更新能力。

2 ADSCs在创伤修复领域的应用

ADSCs在创伤修复领域取得了令人瞩目的成就，如对缺血-再灌注损伤、心脏大血管重建、骨及软骨修复以及肌腱、椎间盘等的修复方面发挥了巨大的作用。

2.1ADSCs在骨组织工程中的应用 大面积骨缺损是临床多学科所面临的一个难题，干细胞及骨组织工程技术给这一难题带来了新思路。对于ADSCs成骨潜能的研究已不局限于体外，目前可利用组织工程技术实现体内成骨。杨世茂等[14]首先制备富血小板纤维(platelet-rich fibrin，PRF)，挤压PRF成膜状结构后用小剪刀剪碎待用，以兔ADSCs作为种子细胞制备ADSCs/β-磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)组织工程骨，将ADSCs/β-TCP与剪碎的PRF共同置于兔下颌骨双侧缺损区，通过大体观察、HE染色及X线检查证实术后骨缺损处骨痂模糊，骨连接紧密，说明ADSCs/β-TCP复合物与PRF联合应用可促进下颌骨缺损的修复。Levi等[15]的研究也证实，新鲜分离的人ADSCs接种至磷灰石/聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架直接就能修复标准的鼠颅骨缺损，且不需要体外成骨预诱导，进一步肯定了ADSCs在骨缺损修复中的应用。

2.2ADSCs在创面修复中的应用 ADSCs通过诱导再上皮化、促进血管形成、旁分泌细胞因子等促进邻近细胞、组织的迁移从而促进创面修复。Herreros等[16]通过Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验观察体外培养扩增的ADSCs治疗克罗恩病引起的肠外瘘的效果并评价其安全性，取患者腹部脂肪来源的ADSCs进行分离、培养和扩增，A组患者将ADSCs注入瘘道口、B组患者将ADSCs与纤维蛋白胶混合后注入到瘘道口、C组将纤维蛋白胶注入瘘道口，瘘道外口用纱布覆盖。结果提示，A、B两组的治愈率显著高于C组，A组与B组比较差异无统计学意义，且ADSCs治疗肠道炎性疾病引起的肠外瘘道是安全的。Trottier等[17]将皮肤与脂肪块分离，分别提取角质细胞、皮肤成纤维细胞及ADSCs，并予以扩增并诱导ADSCs成脂分化，最终将获得的各种细胞成分加以整合，形成一种皮肤替代品。放射性损所伤引起的难以愈合的皮肤溃疡以及伴有糖尿病等基础疾病的皮肤创面一直是整形外科的难题，杨超等[18]采用ADSCs-透明质酸复合物注射治疗SD大鼠放射性复合损伤发现，该方法能促进创面血管再生，加速创面修复。Kajiyama等[19]发现，老鼠的ADSCs可以降低糖尿病鼠的血糖；Kim等[20]使用人ADSCs治疗糖尿病足裸鼠模型，经局部注射人ADSCs并观察25 d后，坏疽的糖尿病足基本恢复正常。

2.3其他 di Summa等[21]发现，大鼠的ADSCs可以促进外周神经的修复。Ryu等[22]观察到，将ADSCs移植到急性脊髓损伤犬模型上有助于神经功能的修复。另外，ADSCs可通过降低肝酶、提高血浆白蛋白而用于肝损伤的修复。Lee等[23]通过移植ADSCs到大鼠模型上发现，其可以延缓舞蹈病的进展，以ADSCs作为载体，将黏液瘤病毒转移到裸鼠，制造神经胶质瘤模型，这项研究使ADSCs成为治疗脑部肿瘤的一种可能的载体。Gonzalez-Rey等[24]根据ADSCs可以抑制免疫系统的某个特定环节，认为可通过ADSCs降低器官排斥反应，用来治疗自身免疫性疾病。Lin等[25]发现，通过移植ADSCs可治疗小鼠动物模型的勃起功能障碍。

3 结 语

ADSCs易于分离和扩增，具有多向分化潜能，在创伤修复领域有着广阔的发展前景。2006年，日本科学家山中申弥等成功诱导出鼠iPS细胞，此项研究成功地将干细胞的研究扩充到一个新的领域：重编程。最近，Sun等[26]已经着手研究ADSCs的重编程。相信随着对ADSCs研究的深入，其在创伤修复领域的应用会越来越广泛。

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