血液制品病毒灭活/去除方法概述

迟妍妍，王 斐，张 惠，臧恒昌

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012;2.山东泰邦生物制品有限公司，山东 泰安 271000;3.北京凯元盛世科技发展有限责任公司，山东 济南 250012)

血液制品［1］是指各种人血浆蛋白制品，包括人血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、人凝血因子、人凝血酶原复合物等，是临床上广泛使用的一类重要的生物制品。血液制品原料是人类血浆，而目前已知经血液制品传染的病毒［2］主要有人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、人体T细胞白血病病毒(HTLV)和细小病毒B19等。为保证血液制品安全性，主要采取三个有效措施［2，3］:①对献血者的精密筛选，确保血源的安全性;②对每人份血液/血浆进行病毒的系统检测;③生产过程中进行的有效的病毒灭活/去除。因此，为提高血液制品安全性，病毒灭活/去除方法［4］的选择具有重要意义。

1 化学法

1.1 有机溶剂/表面活性剂(S/D)法 早在20世纪80年代中期S/D法开始发展应用，目前依然是血液制品中一种核心的病毒灭活方法。此方法的基本原理是:有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜，从而使类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力。Roberts［5］对S/D法用于高纯度的凝血因子进行病毒灭活的有效性进行了详尽的考察。结果显示，以0.3%的TNBP和1%的Triton－X100为S/D试剂，在22℃条件下处理30min后可以对凝血因子制品中的牛痘病毒、单纯疱疹病毒、辛德毕斯病毒等模拟脂包膜病毒进行有效的灭活，证实了S/D法用于脂包膜病毒灭活的稳健性和有效性。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的灭活。

1.2 低pH孵放法 低pH孵放在20世纪80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制备过程中防止免疫球蛋白的聚合，随后发现其对大部分的脂包膜病毒有灭活作用，后被用于血液制品的病毒灭活。灭活机理是:在pH 4，温度30～37℃条件下保温超过20 h，某些病毒成分产生变质，从而影响病毒的复制，最终使病毒失去传染性。Roberts等［6］对孵放法进行了考察，研究表明，在pH 5、30℃条件下对静脉注射用免疫球蛋白持续处理14 d能够对脂包膜病毒和部分非包膜病毒进行有效的灭活。证实了该方法可以作为生产过程的终端处理，和S/D法、离子交换层析法结合共同用于注射用免疫球蛋白的病毒灭活，保证免疫球蛋白产品的安全性。该方法要求蛋白质产品的活性在低pH条件下保持稳定，因此一般只用于免疫球蛋白脂包膜病毒的灭活。

1.3 辛酸处理法 早在20世纪90年代初，Lundblad等［7］报道了辛酸钠灭活4种脂包膜蛋白的机制，揭开了辛酸法在病毒灭活中的应用。此法是在低pH条件下，辛酸的非离子形式具有亲脂性，能够进入病毒脂包膜从而破坏脂质双分子层和相关蛋白质的完整性，使脂包膜病毒失去传染性，达到脂包膜病毒的灭活作用。Dichtelmüller等［8］以3批注射用免疫球蛋白制剂作为研究对象，对辛酸法用于免疫球蛋白溶液病毒灭活的有效性进行了考察。结果显示，7.45 g·kg－1的辛酸溶液能够在极短的时间(1min)内对人免疫缺陷病毒、牛病毒性腹泻病毒、辛德毕斯病毒、伪狂犬病病毒进行有效的灭活。由于辛酸法需要在低pH(通常pH＜6)条件下发挥作用，要求蛋白质产品在低pH条件下能够保持其稳定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒灭活。

1.4 光化学法 亚甲蓝(MB)/可见光处理法、补骨脂素/UVA处理法、核黄素/UV处理法等是目前常用的光化学方法［9］，主要用于全血浆以及血小板制品的病毒灭活。

MB/可见光法病毒灭活的原理［10］是:MB是一种带正电荷的感光吩噻嗪染剂，可以穿过病毒的包膜与核酸结合，在一定强度的光照射下发生光化学反应，产生羟基自由基和单态氧，阻止核酸的复制从而达到病毒灭活的目的。此法对脂包膜病毒有良好的灭活效果，对非包膜病毒灭活效果不理想。此外，对于不稳定的蛋白产品可能造成功能活性的损失，目前多有文献报道［11］此病毒灭活方法对于血浆蛋白的影响变化。

补骨脂素/UVA法病毒灭活的原理［12］是:补骨脂素分子能够可逆的嵌入DNA、RNA螺旋中，在长波紫外线(UVB)的照射下，补骨脂素分子与嘧啶碱基相互作用，阻止病毒的复制，使其失去传染性。此方法的病毒灭活效果以及缺陷与MB/可见光法相似。

核黄素/UV法的原理［13］是:核黄素是小分子物质，能够插入核酸内部，在UV的作用下，通过可逆性氧化还原反应转移电子，使鸟嘌呤氧化，病毒无法复制从而使其失去传染性。此法对脂包膜病毒以及一些非包膜病毒的灭活作用效果显著，但是也容易造成不稳定蛋白的失活。

2 物理法

2.1 巴氏消毒法 巴氏消毒法是在60℃条件下对蛋白质溶液进行连续加热至少10 h，使病毒蛋白变性，从而抑制病毒遗传物质的复制，最终使病毒失去传染性。Chandra等［14］通过相关文献的检索对巴氏消毒法进行了详细的综述，结果表明巴氏消毒法只需要控制很少的过程参数，灭毒过程容易被监测，对脂包膜病毒和非包膜病毒均有灭活作用，灭毒范围广。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。虽然巴氏消毒法目前已成为一种广泛的血液制品病毒灭活方法，但同时存在着一些局限性:①蛋白质稳定剂的加入降低了病毒灭活的能力;②细小病毒B19有耐热性，不利于该病毒的灭活;③在热条件处理下会导致蛋白质产品的变性，使产品的活性降低，因此不能用于稳定性不好的血浆蛋白的病毒灭活。

2.2 干热处理法 干热法最早于20世纪80年代初被用于凝血因子制品中肝炎病毒的灭活，1984年，干热法被批准用于HIV的灭活。其原理是:制剂冻干后加热处理，使病毒复制所需要的分子和结构改变，从而抑制其复制过程。干热法常用的处理条件有60℃、96 h，80℃、72 h以及100℃、30min。Seop等［15］通过对冻干后的凝血因子进行干热法病毒灭活的研究发现，在100℃、30min的处理条件下，此病毒灭活方法除了对猪细小病毒的灭活不理想外，对其他病毒均有良好的灭活效果，而且经过此方法后凝血因子的失活仅在5%左右，没有发现蛋白制品的物理或生物学性质发生变化，证明了干热法作为最终病毒灭活的关键步骤，能够保证凝血因子产品的病毒安全性。由于对病毒灭活能力的限制，此方法常用于凝血因子制品的辅助病毒灭活方法。

3 病毒去除方法

3.1 纳米膜过滤［4］纳米膜过滤病毒去除技术是使用15～45 nm之间的滤膜对血液制品溶液进行过滤，利用筛分原理，在纳米膜过滤中，大于滤膜孔径的病毒或其他病原体被截留在薄膜上，尺寸较小的蛋白产品则能通过滤膜继续存留在溶液中。继20世纪90年代初中期被引进用于病毒去除以来，纳米膜过滤技术已经发展成为一种广为接受的稳定可靠的病毒去除方法，并且用于除了白蛋白制品之外的其他血液制品的病毒去除过程。Caballero等［16］考察了巴氏消毒法结合纳米膜过滤去除病毒的有效性，以猪细小病毒作为模拟病毒，结果发现通过孔径为20 nm的纳米滤膜后病毒滴度下降＞4log，证实了纳米膜过滤结合巴氏消毒法和S/D法用于一种新的免疫球蛋白制品病毒去除的有效性。纳米膜过滤法能够有效去除非包膜病毒以及其他难以灭活的致病病原体，提高了目标蛋白产品的安全性，并且蛋白生物活性回收率能够达到90%～95%。

3.2 其他方法 蛋白产品的制备过程中常包含有沉淀步骤，同时也有病毒去除的作用。在冷乙醇沉淀过程中，各种病毒可能被分离至废弃组分中，蛋白纯化的同时进行部分病毒的移除。深度过滤是一种重要的蛋白纯化手段，滤材会对部分病毒产生吸附，从而去除病毒。层析技术是目前迅速发展的一种蛋白纯化方法，在纯化过程中蛋白产品被吸附在层析柱而病毒存在于流动相中，在蛋白纯化的同时进行病毒的去除。Roberts等［6］经研究发现，静脉注射用免疫球蛋白产品经离子交换层析过程后，1型单纯疱疹病毒和牛乳头状瘤病毒的滴度下降＞5log，能够对病毒有效的去除，对其他模拟病毒虽有一定的去除作用，但是不能达到有效的移除。

以上冷乙醇沉淀、深度过滤、层析等都是蛋白产品的生产过程，同时也具有病毒移除的作用。但是这些过程对病毒的移除能力有限，因此只能作为一种辅助的手段。

4 结语

综上所述，目前化学法中的S/D法、低pH孵放法、辛酸法、光化学法，物理法中的巴氏消毒法和干热法等是血液制品制备过程中核心的病毒灭活方法。此外，纳米膜过滤、冷乙醇沉淀过程、深度过滤、层析法等方法虽然不能保证去除所有的病毒，但是和核心的病毒灭活方法相结合，共同保证病毒的彻底灭活/去除，保证血液制品的安全性。如今，血液制品安全性的保证是主要目的，而病毒的有效灭活/去除的环节至关重要。由于单一病毒灭活/去除方式的局限性，存在对有些病毒(尤其是非包膜病毒)不能完全的去除的可能性，因此目前生产过程中一般采用两种或两种以上的病毒灭活/去除方法以保证血液制品的安全性。为更好地达到病毒灭活/去除的目的，更有效、安全的方式也在不断研究与开发中，不同方式的有机结合也将是新的发展方向。

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