高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗体及表位的鉴定

蔡孟华，李 铮，董 鹏，吴瑞平，何 维*

（中国医学科学院北京协和医学院1.基础医学研究所免疫学系;2.病原生物学研究所，北京 100005）

高致病性禽流感病毒H5N1，属于甲型流感病毒，主要在禽类之间传播导致数以百计的家禽死亡。自1997年香港首次报道人感染H5N1病例以来，迄今为止全球累计感染641人，死亡380人，其中中国感染45人，死亡30人，感染致死率66.7%。禽流感病毒的传播已突破物种间屏障，获得了直接感染人的能力，虽然没有确凿的证据证明禽流感病毒可以在人群之间直接相互传播［1］，然而已证明经过多次传代或者点突变的禽流感病毒能够在哺乳动物雪貂之间进行直接相互传播［2－3］。H5N1病毒借助表面的HA与宿主细胞表面受体结合感染宿主细胞，同时HA也是宿主产生中和抗体的重要抗原。本研究拟通过表达串联抗原表位的病毒样颗粒为免疫原制备单抗，分析鉴定中和表位，为研制表位肽疫苗及抗体治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Sf9细胞、MDCK细胞和HEK293T细胞为实验室保存;质粒 HA-pcDNA3.1、NA-pcDNA3.1和PNL4-3为实验室构建;DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和胎牛血清（Gibco公司）;转染试剂lipofect2000（Invitrogen公司）;细胞裂解液及荧光素酶底物（Promega公司）;牛血清白蛋白BSA、小鼠抗体亚型检测试剂盒（Sigma公司）;Protein G HP亲和柱（GE Healthcare公司）;BCA蛋白浓度检测试剂盒（Pierce公司）;抗His单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗兔IgG（中杉金桥生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗HA表位肽抗体制备:选取9条候选表位［4］相应位点的10肽片段序列（表1），设计成4条串联表位序列（表2）。由艾比玛特生物医药公司制备单克隆抗体，共获得23株单克隆抗体腹水。

1.2.2 抗体纯化鉴定:将腹水高速离心15 min，取上清0.45 μm滤膜过滤备用。以20～30个柱床体积的PBS平衡Protein G柱，将经过滤的腹水上清反复上样，加入甘氨酸（pH 2.7）缓冲液洗脱，在预先加入Tris-HCl（pH 9.0）的微量管中收集洗脱液，－20℃保存，备用。

1.2.3 抗体亚型鉴定:稀释抗体至1 mg/L包被96孔板，37℃孵育1 h，PBST洗涤后加入山羊抗鼠免疫球蛋白不同亚型的抗体反应30 min，洗涤3次，加入HRP标记兔抗羊IgG反应30 min。显色终止，酶标仪测定。

表1 合成多肽信息表Table 1 Information of synthetic peptides

表2 设计串联表位肽信息表Table 2 Information of tandem epitope peptides

1.2.4 假病毒微量中和实验:包装5株H5N1假病毒，分别为青海（禽）株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05 H5N1、新疆（人）株 A/Xinjiang/01/06 H5N1、越南（人）株A/Viet Nam/1203/04、新西伯利亚（禽）株A/duck/Novosibirsk/56/05和印度尼西亚（人）株A/Indonesia/5/05，其中 QH H5N1、XJ H5N1 和 NV H5N1属于clade 2.2，IN H5N1属于clade 2.3.1，VN H5N1属于clade 1，这些毒株涵盖了中国境内流行的H5N1病毒主要分枝。包装步骤:提取转染质粒（HA-pcDNA3.1，NA-pcDNA3.1，PNL4-3），以 HA∶NA∶PNL4-3=1∶1∶2 的比例转染 HEK293T 细胞，48 h收集上清并过滤。测定病毒半数组织培养感染量（TCID50），以100×TCID50/孔作为感染剂量，病毒稀释液依次稀释抗体，混合病毒和抗体室温放置30 min加入犬肾细胞。48 h弃细胞上清并洗涤，加入30 μL细胞裂解液，室温裂解30 min，加入50 μL荧光素酶底物检测发光值，即相对发光单位（relative luminescence units，RLU），重复3 次平行实验，计算公式1－（实验孔RLU均值－细胞对照RLU均值）/（病毒对照RLU均值－细胞对照RLU均值），即所测样品的抑制率百分数，根据抑制率百分数拟合曲线计算IC50，以表示抗体的中和活性。

1.2.5 抗体与合成肽的结合实验:合成9条10个氨基酸多肽，经HPLC分析纯度均大于90%（表1）。将不同合成肽包被96孔板（5 mg/L），室温封闭2 h加入倍比稀释的待鉴定抗体，孵育1 h，洗涤3次与HRP标记羊抗鼠IgG反应1 h后显色终止，酶标仪测定。平行重复3次实验，取平均值进行统计学分析。

1.2.6 抗体与rHA的结合实验:采用昆虫表达系统表达4种含有6个组氨酸标签的HA（His-HA），分别命名为 XJ-rHA、QH-rHA、HK-rHA和AH-rHA。Western blot检测单抗与上述rHA的结合。rHA经12%SDS-PAGE分离转移至PVDF膜，将稀释的待鉴定抗体与剪切膜室温孵育1 h，洗膜3次，加入HRP标记山羊抗鼠IgG室温作用1 h，重复洗涤滴加底物，化学发光成像鉴定。

2 结果

2.1 亲和层析纯化腹水检测抗体亚型

亚型结果显示10株为IgG型，其中绝大多数为IgG1和IgG3亚型，部分为IgG2a和IgG2b亚型（表3）。10%SDS-PAGE鉴定，纯化后的10株IgG型单抗都具有55 ku和25 ku两条蛋白染色带（图1）。

2.2 假病毒微量中和实验

10株单抗以高中低3个剂量浓度对QH H5N1假病毒进行中和活性筛选（图2）。

具有中和活性者被进一步稀释测定。其中2株单抗具有对QH、XJ、VN和NV H5N1高效中和活性，1株单抗对QH、XJ有中和活性。在所用的抗体浓度下，3株抗体对IN H5N1无中和作用（图3，表4）。

表3 单克隆抗体的亚型鉴定Table 3 Isotype of mAbs

图1 纯化后的抗表位肽单抗的SDS-PAGE图Fig 1 10%SDS-PAGE for purified mAbs against antigenic epitopes

图2 单克隆抗体对QH H5N1假病毒中和活性的筛选Fig 2 Screen neutralizing antibodies against QH H5N1 pseudotypes

图3 单克隆抗体对QH、XJ假病毒中和活性Fig 3 Neutralization by antibodies against QH/XJ H5N1 pseudotypes

表4 单克隆抗体对H5N1假病毒半数抑制浓度Table 4 IC50s of antibodies 22L1，17D2 and 6A2 against a panel of H5N1-pseudotypes

2.3 中和抗体与表位肽的结合实验

3株中和抗体，其中Mab 6A2和17D2可与Pc剂量依赖性特异性结合，Mab 22L1能识别一个氨基酸差异的Pa与Pb，其结合具有抗体剂量依赖性（图4）。提示Pa、Pb和Pc可能是产生中和抗体的优势表位。

图4 单抗对表位肽的剂量依赖结合实验Fig 4 Dose dependent of binding of mAbs against epitopes

2.4 免疫印迹鉴定中和抗体对4种HA蛋白的结合

与阳性抗his抗体比较，3株中和活性抗体均能结合4种rHA，在70 ku有特异性杂交条带（图5）。同时采用HEK293T细胞和Sf9昆虫细胞的全细胞裂解液作为阴性对照，没有杂到任何条带（结果未列出）。

图5 中和活性单抗的Western blot检测Fig 5 Western blot for neutralizing monoclonal antibodies

3 讨论

高致病性禽流感H5N1病毒血凝素蛋白HA是病毒结合宿主细胞表面受体，介导病毒入胞的关键分子，也是中和抗体及疫苗研制的主要靶标分子。HA蛋白由HA1和HA2两个亚单位通过富含碱性氨基酸的裂解区域连接，羧基末端疏水区（HA1）插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是HA与受体分子的结合部位，氨基末端疏水区（HA2），具有膜融合活性，是病毒侵入宿主细胞必须部分［5－6］。在抵御病毒感染过程中，中和抗体能有效地保护机体清除病毒。本研究所获得的中和抗原表位“LIKKNNAYPT”和“R/KSSFFRNVVW”所在区域与利用合成肽阻断HA蛋白与单抗结合鉴定单抗结合区域筛选抗原表位相吻合［7］。

利用串联表位肽制备鉴定单克隆抗体，获得具有中和活性的单抗及其特异识别的表位。3株具有高效活性的中和抗体能够特异识别HA1 143～163位点的多肽。所获中和抗体能够与高温变性的4种rHA蛋白结合，但不能与直接包被的rHA蛋白结合，提示上述单抗倾向于识别线性表位。今后可对其进行人源化改造，为抗体治疗奠定基础。

由于HA基因抗原漂移以及与人类抗体识别谱相似的类人类抗体环境导致禽流感病毒不断变异，突破物种间屏障获得直接感染人的能力，目前预防人感染禽流感最行之有效的的方法仍然是疫苗免疫。传统的流感疫苗使用的基因型根据WHO每年提供的毒株类型确定，这些疫苗在亚洲的保护效果并不令人满意［8－9］。本研究致力于分析中国境内流行病毒株，所获得的候选表位为针对中国地区流行株新型疫苗的研发奠定了基础。

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