连翘苷快速提取纯化工艺研究*

李飞鹤杜杰 陈廷贵*栗亚云 席小莉 张立伟

（化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学分子科学研究所，山西太原030006）

连翘苷快速提取纯化工艺研究*

李飞鹤**杜杰 陈廷贵***栗亚云 席小莉 张立伟

（化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学分子科学研究所，山西太原030006）

连翘是最广泛使用的传统中药之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化活性等重要的药理作用，而连翘苷是连翘的主要生物活性成分。为了从连翘叶中快速简便地提取、分离和纯化得到纯度较高的连翘苷，试验采用无水乙醇和体积浓度85%乙醇回流提取，大孔树脂柱层析和石油醚萃取的方法分离，重结晶法进行纯化，经不同组合试验以确定最佳制备工艺。通过HPLC测定比较所得连翘苷的含量、纯度，最终确定了以无水乙醇回流提取，石油醚萃取分离，重结晶纯化的工艺流程，通过该方法可以得到纯度达90%的连翘苷。

连翘叶；连翘苷；高效液相色谱法；提取；分离；纯化

连翘为木犀科连翘属植物，是临床常用传统中药之一。《中国药典》中描述：连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效。现代药理研究表明：连翘具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗内毒素、抑制弹性蛋白酶活力、抑制磷酸二酯酶、强心利尿、解热、抗肝损伤及治疗肝炎等作用。

连翘化学成分较多，据目前报道，主要含有木脂素类、萜类、挥发油类、黄酮类、香豆精、苯乙醇及其甙类等。其中连翘苷是其最主要的质量控制指标，连翘药材中连翘苷含量不得少于0.15%。连翘苷为木脂素苷类化合物，其化学式为C27H34O11，分子量为534，熔点为181℃，难溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。

大量的研究结果证明，连翘叶中的化学成分与连翘果实中的化学成分有非常好的一致性，而且连翘叶中有许多化学成分的含量远远高于连翘果实，如连翘叶中连翘苷约占5%，连翘果实中连翘苷约占0.2%，含量差别超过20倍。由于连翘叶中有许多化学成分的含量远远高于连翘果实，所以连翘叶虽不能入药，但在制备单体化合物如连翘苷等方面具有较大的优势，同时也大大节省了连翘果实在制备单体化合物中的浪费现象，充分利用了秋季连翘叶落叶的价值。

本文设计了连翘苷的2种提取方法、2种分离方法和1种纯化方法，通过各种方法的不同组合试验，以确定快速简便地制备高纯度连翘苷的工艺流程，为连翘苷的药理作用研究打下基础，同时为其他研究者快速制备出高纯度连翘苷提供一定参考。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪，上海申生科技仪器有限公司；SHZ-C型循环水式多用真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Scientz-12N真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；KQ3200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；微型高速万能试样粉碎机，黄烨市齐家容科学仪器厂；鼓风数显干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SpectraMax 190酶标仪，美国Molecular Devices公司。

连翘叶，于2012年8月份采于山西大学校园内。

2 试验方法

2.1 高效液相色谱条件及方法学考察

2.1.1 分析条件

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。色谱柱为SHMADZU VP-ODS C18（250 mm× 4.6 mm），流动相为水（A）：乙腈（B）体积比为75∶25；流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温25℃；检测波长277 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备

取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.54 mg/mL的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取待测品粉末约0.1 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，精密加入体积浓度70%甲醇8 mL，摇匀，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，再用体积浓度70%的甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。

2.1.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与待测品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以连翘苷对照品的峰面积为对照，计算连翘苷的含量。待测成分色谱峰以连翘苷对照品色谱峰相对保留时间确定。连翘苷的峰位，其相对保留时间应在规定值的5%范围之内。

2.1.5 线性关系的考察

精密量取对照品溶液1 mL，分别配置质量浓度为15.62 μg/mL、31.25μg/mL、62.50μg/mL、135.00 μg/mL、270.00 μg/mL、540.00 μg/mL的标准溶液。按2.1.1的测试条件检测峰面积，平行测定3次，以连翘苷的进样质量浓度（μg/mL）为横坐标，以连翘苷的峰面积为纵坐标，线性回归，得连翘苷的回归方程为y=7 961.3x+81.412，R2=0.999 8，结果表明连翘苷在15.62 μg/mL～540.00 μg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2 连翘苷提取溶剂的选择

2.2.1 无水乙醇提取

准确称取连翘叶200.0 g，每次加入2 000 mL无水乙醇回馏2次，每次l.5 h，将提取液过滤；滤液混合后浓缩至糊状，加热水煮沸，趁热过滤，得粗产物，弃去沉淀，滤液浓缩至200 mL，然后置于4℃冰箱保存4 h～8 h；待析出沉淀后，减压抽滤，取沉淀，得到粗产物。干燥后称重并检测纯度。

2.2.2 体积浓度85%乙醇提取

准确称取连翘叶200.0 g，每次加入2 000 mL 85%乙醇回馏2次，每次l.5 h，提取方法同2.2.1。

2.3 连翘苷分离方法的选择

2.3.1 大孔树脂吸附

将2.2.1、2.2.2所得的乙醇粗提物分别用体积浓度30%乙醇溶解，加入大孔树脂柱吸附，先用8（倍体积）BV体积浓度30%乙醇洗杂质，再用18BV体积浓度60%乙醇溶液洗脱，最后再用体积浓度80%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，洗脱液浓缩回收乙醇，浓缩液放置4℃冰箱中结晶，滤出得粗结晶；冷冻干燥后分别称重并检测纯度。

2.3.2 石油醚萃取

将2.2.1和2.2.2所得的乙醇粗提物分别取1 g，用体积浓度50%的乙醇溶液，加入适量的石油醚，混匀，待静置分层后，回收下层液体浓缩回收乙醇，浓缩液放置冰箱中结晶，滤出得粗结晶，干燥后称重并检测纯度。并将石油醚萃取的上下两层溶液分别用酶标仪在200 nm～800 nm之间扫描，测其吸收峰。

2.4 连翘苷重结晶纯化

将得到的粗结晶用无水乙醇溶解，稍微加热，待全部溶解后冷却，放置冰箱中结晶，12 h后，减压抽滤，得到连翘苷晶体，重复2～3次。最后真空干燥，称量并测其纯度。

3 结果分析

3.1 连翘苷的提取、分离、纯化

3.1.1 连翘叶－无水乙醇提取－大孔树脂柱层析－重结晶结果

将200 g连翘叶经过无水乙醇提取得到粗提物3.95 g，其纯度为60.23%。经大孔树脂分离、冷冻干燥最终得到以下组分：体积浓度30%乙醇洗脱液浓缩干燥所得物为1.06 g，HPLC未能检测到连翘苷，表明体积浓度30%乙醇无法将其洗脱。体积浓度60%乙醇洗脱液浓缩干燥后得到2.60 g，其连翘苷纯度为66.71%。体积浓度80%乙醇洗脱液浓缩干燥后有0.06 g，其连翘苷纯度为46.86%。随后将纯度达66.71%的连翘苷粗结晶进行数次重结晶。

3.1.2 连翘叶－体积浓度85%乙醇提取－大孔树脂柱层析结果

将200 g连翘叶经过体积浓度85%乙醇提取得到粗提物34.54 g，其纯度为9.75%。经大孔树脂分离、冷冻干燥后，最终得到以下组分：体积浓度30%乙醇洗脱液浓缩干燥所得物为23.44 g，HPLC未能检测到连翘苷。体积浓度60%乙醇洗脱液浓缩干燥后得到10.15 g，其连翘苷纯度为30.80%。体积浓度80%乙醇洗脱液浓缩干燥后，其连翘苷纯度为0.51%。从以上数据可知，体积浓度60%乙醇洗脱得到的连翘苷粗结晶为10.15 g，纯度达30.80%，由于其纯度较低，未进行重结晶。

3.1.3 连翘叶－无水乙醇提取－石油醚萃取－重结晶结果

将200 g连翘叶经无水乙醇提取，石油醚萃取后，对萃取溶液的上下层分别在酶标仪上测其200 nm～800 nm之间的吸光度曲线，图略。由萃取溶液上层吸光度曲线可知，石油醚已把叶绿素A和叶绿素B萃取干净。由萃取溶液下层吸光度曲线可知，下层乙醇溶液中已没有叶绿素A和叶绿素B杂质。下层乙醇溶液浓缩，静置沉淀，过滤干燥后得到连翘苷粗结晶2.88 g，纯度为66.93%，随后进行数次重结晶。

3.1.4 连翘叶－体积浓度85%乙醇提取－石油醚萃取结果

将200 g连翘叶经体积浓度85%乙醇提取，石油醚萃取后，下层溶液浓缩，静置沉淀，过滤干燥后得到连翘苷1.59 g，纯度为50.65%。由于其纯度较低，未再进行重结晶。

4 讨论

由以上试验可知，连翘叶经无水乙醇提取比用体积浓度85%乙醇提取效果好。虽然体积浓度85%乙醇的提取率较高，但由于纯度较低，再经大孔树脂或石油醚萃取后，提取率和纯度反而变得较低；石油醚萃取所得连翘苷粗品质量较大，纯度也相对较高，考虑到大孔树脂柱层析耗时过长，操作过程繁琐，选择石油醚萃取较好。总之，选择连翘叶－无水乙醇提取－石油醚萃取－重结晶提取连翘苷效果最好。

在有关制备连翘苷的文献中，有的用碱性溶液提取，使得连翘苷容易分解，且需进行大孔树脂、氧化铝柱层析，耗时会大大增加，有的未去除叶绿素，将很难达到满意结果。本研究运用无水乙醇提取－石油醚萃取－重结晶方法，快速简便地获得了高纯度的连翘苷，纯度达到90%以上，提取率为1.21%，这为连翘苷的药理作用研究打下了基础，也为其他研究者快速获得高纯度连翘苷提供了一种可行方法。虽与文献中连翘苷含量98%，提取率为1.64%相比，本试验方法得到的连翘苷的纯度和提取率相对较低，会浪费一定的连翘叶资源，但相对于经过复杂制备过程获取连翘苷，或者高价大量购买连翘苷标准品做体外、体内药理试验，尤其是数星期的体内药理试验，本研究方法值得提倡。

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表5 正交试验因素与水平设计

由正交因素水平表，可以设计3因素3水平的正交试验，正交试验结果与分析见表6。

表6 正交试验结果与分析

3.2 极差分析

根据正交试验表的试验数据，由极差分析的结果，明显可以看出极差越大，说明该因素对指标的影响越大。得出B＞C＞A，即影响该生产工艺的主次关系依次为：木糖醇的添加量＞复合稳定剂添加量＞南瓜浆添加量。生产木糖醇南瓜酸奶的最优组合为A2B2C2，因此了确定最佳工艺参数为南瓜浆的添加量为7.5%，木糖醇的添加量为8.0%，复合稳定剂添加量为0.4%，发酵剂的添加量为4.0%，发酵温度为42℃，发酵时间为4 h。

4 结论

由上述试验和分析，可以得出木糖醇酸奶的最佳工艺为南瓜浆的添加量为7.5%，木糖醇的添加量为8.0%，复合稳定剂添加量为0.4%，发酵剂的添加量为4.0%，发酵温度为42℃，发酵时间为4 h，采用该工艺制作出来的酸奶呈现浅黄色，凝固性好，酸甜适度，有浓郁的南瓜奶香味，口感细腻。在木糖醇的单因素试验中，木糖醇的添加量对于指标的影响并不明显，因此要通过正交试验验证最优的工艺组合。

在酸奶发酵结束时，要将酸奶及时转移，必要时要对酸奶采取水淋等方式来及时降温，这样才能避免乳酸菌的过分发酵，导致酸奶酸味过重，口感差。木糖醇南瓜酸奶有清凉独特的口感，营养丰富，兼保健美味于一体，符合当代人们的生活需求，具有广阔的发展前景。

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Rapid extraction and purification of forsythin from forsythia suspensa leaves

LI Fei-he**DUJie CHENTing-gui***LI Ya-yun XI Xiao-li ZhangLi-wei
（Key laboratory of chemical biology and molecular engineering ofministry of education，Institute ofmolecular science，Shanxi university，Shanxi Taiyuan 030006，China）

Forsythia suspensa is one of most widelyused traditional Chinese medicines, and possesses important biologicalactivities, including antibacterial, antiviral, anti- inflammatory and antioxidant activities.Forsythin is the main bioactive component of forsythia suspensa.This paper aimed to obtain highly purified forsythin fromforsythia suspensa leaves quickly and easily, and to study its pharmacological effects in future.The study designed a series of methods, extraction methods containing anhydrous ethanol and 85% ethanol extract, separation methods adoptingmacroporous resin column chromatography and petroleum ether extraction, purification method employing recrystallization.Through HPLC determined the content and purityofforsythin, a bettermethodwas foundedwhich included anhydrous ethanol extraction, separation of petroleumether and recrystallization.At last，a certain amount of 90%purity forsythin had been extracted by the method.

forsythia suspensa leaves；forsythin；high performance liquid chromatography；extractin；separation；purification

TS272

A

1673-6044（2014）02-0032-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.02.012

山西省科技基础条件平台建设项目（2012091015）。

**李飞鹤，女，1986年出生，山西大学分子科学研究所无机化学专业在读研究生。

***陈廷贵，通讯作者，E-mail：chentg@sxu.edu.cn.

2014-03-26