重庆地区12196例妇科门诊患者HPV亚型感染情况分析＊

鄢春晖，陈 林，袁蔓莉，周 晓

（重庆市第四人民医院妇产科400014）

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡DNA病毒，定向感染人类皮肤及黏膜组织，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。目前已鉴定出100多种亚型，其中40 多种与生殖器皮肤黏膜的病变有关，根据其致癌性分为高危型和低危型2 类，前者常引起宫颈癌等恶性病变，后者常引起尖锐湿疣等良性病变。流行病学研究表明，高危型HPV的持续感染是引起宫颈癌的主要原因［1］。1999年，国际癌症研究机构（IARC）通过对22个国家一项研究显示，在99.7%的宫颈癌组织中检测到HPV-DNA［2］。

HPV基因序列的多样性造成各地区H P V亚型的分布存在着一定的差异［3］，这些差异导致病毒DNA的结构域或功能域发生变化，从而影响宿主对病毒的免疫应答。因此，了解HPV亚型在不同地区的分布及感染情况，对HPV感染的诊断和防治具有重要意义。本文旨在通过对重庆地区12196例妇科门诊患者HPV亚型感染情况的研究，为重庆地区HPV感染的流行病学研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年1月至2013年12月来本院妇产科门诊就诊的12196例女性患者为研究对象，291 人年龄不详，其余年龄15～68岁，其中，≤25岁6266例，26～35岁3107例，36～45 岁1842例，≥46 岁690例。纳入标准：患有1 种或几种宫颈疾病，没有做过宫颈切除手术，标本采集时不处于月经期，除去复查患者。全部标本采集均由医师征得患者同意并承诺保护患者隐私。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 标本采集前3 d 不得冲洗阴道，24h 内不得有性行为，未处于经期。用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，取出宫颈刷于宫颈口单向旋转4～5 周，以获得足量的上皮细胞，然后将其放入盛有生理盐水的采集管中，2～8 ℃保存，7 d 内检测，-20 ℃保存不超过3 个月。

1.2.2 主要仪器与试剂HPV基因分型（23 型）检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司），MG96＋型PCR扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司），FYY-3 型分子杂交仪（兴化市分析仪器厂）。

1.2.3 检测方法 （1）HPV DNA提取：取宫颈细胞采集液1 mL 于1.5 mL离心管中，13000r／min 离心10 min，弃上清液。加入50μL 细胞裂解液，混匀，100 ℃煮沸10 min，13000 r／min 离心10 min，保留上清液备用。（2）PCR扩增：PCR反应体系（深圳亚能生物技术有限公司提供），PCR反应液20μL，加入模板DNA 5μL，反应前每管滴加1 滴矿物油。PCR温控体系，50 ℃15 min，95 ℃10 min；94 ℃30 s，42 ℃90 s，72 ℃30 s，40 个循环；72 ℃5 min。（3）反向膜杂交：取15 m L离心管，放入标有样本编号的膜条（应在膜条编号处用中性笔标记），加入8 mL 杂交液［2 ×标准枸橼酸盐水（SSC），0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）］和25μL PCR产物，沸水浴10 min，取出，拧紧瓶盖，50℃杂交90 min。取出膜条，放入盛有50 m L 洗涤液（0.5 ×SSC，0.1%SDS）的离心管，50℃洗膜10 min，阴性质控品和阳性质控品同步处理。（4）洗膜：按杂交液∶过氧化物酶（POD）＝2000∶1 配制孵育液（2 张膜条需4 m L POD，配制成8 m L孵育液，4 张膜可用6μL POD母液，配制成12mL 孵育液），室温轻摇孵育30 min，弃掉孵育液。用杂交液室温轻摇2 次，每次5 min。用0.1 mol 柠檬酸钠溶液室温轻洗1～2 min，同时配制显色液，显色液需新鲜配制，0.1 mol 柠檬酸钠溶液∶四甲基联苯胺（TMB）∶30% H2O2＝19 mL∶1 mL∶2 μL）。将膜条浸泡于显色液中，避光显色至少30 min，转移至去离子水中浸泡即可观察结果。

1.2.4 质量控制 所有检验人员均经过专业的培训，拥有PCR上岗证件；实验前对操作区进行30 min 紫外灯照射，检验设备和检验试剂均通过国家临检中心认证；每次实验均设有阴性对照和阳性对照。

1.2.5 结果判定 膜条上有24 个圆形斑点，其中PC点为显色质控点，其他23 个斑点均有相应HPV亚型所对应的探针。每张膜条PC 位点处均应有蓝色斑点出现，此时结果的判读视为成功，PC 位点不显现蓝色斑点则提示实验失败。阴性质控的杂交膜条除PC 位点有蓝色斑点外，其他位点均不出现显色信号；阳性质控品处PC位点出现显色信号外，必须在相应HPV基因型位点出现显色信号，否则说明实验失败，提示PCR扩增或杂交失败。

1.3 统计学处理HPV感染具有显著的年龄差异性，为了更好地反应不同年龄段间HPV感染的情况，参照文献［4］发布的世界人口统计标准，将年龄分成4 组，≤25、26～35、36～45、≥46 岁。所有数据通过SPSS19.0 和Excel 2003 进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t 检验；计数资料以率或百分比表示，采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各年龄段HPV感染情况 在受检的12196例标本中，共检测出3754例HPV阳性患者，检出率为30.8%。≤25、26～35、36～45、≥46 岁受检者HPV检出率分别为31.6%、28.5%、28.8%和37.5%，不同年龄段HPV感染率呈现出“U”形曲线（图1）。4 个年龄段中，≥46年龄段HPV感染率最高，与其他3组比较差异有统计学意义（χ2＝29.67，P＜0.05），见表1。

2.2 各年龄段HPV感染构成比3754例阳性标中，各年龄段HPV单重感染率和多重感染率之间有差异有统计学意义（χ2＝129.76，P＜0.05）。每个年龄组的主要感染构成均为单重感染，其中36～45 岁年龄段单重感染率（78.15%）显著高于其他年龄段；各年龄段多重感染患者中，以二重感染为主，≤25岁年龄段的三重和四重感染率显著高于其他年龄段；在26～45 岁年龄段，多重感染率的分布呈下降趋势，46 岁以后多重感染有所回升，见表2。

图1 各年龄段HPV感染曲线

表1 各年龄段HPV感染情况统计表［n（%）］

表2 各年龄段HPV感染构成比（%）

2.3 HPV阳性标本主要型别分布 本次研究检测出全部23种亚型，其中高危型18 种，低危型5 种。3754例HPV阳性标本中，高危型感染数为2315（61.67%）例，排在前6 位的分别为HPV58（10.34%）、HPV16（10.24%）、HPV52（10.09%）、HPV56（6.49%）、HPV33（5.66%）、HPV18（4.56%）；低危型感染 数 为797（21.23%）例，前3位 为HPV6（10.70%）、HPV43（7.31%）、HPV11（4.60%）；高低危混合感染数为642（17.10%），见表3。

表3 阳性标本中各主要型别HPV的分布

续表3 阳性标本中各主要型别HPV的分布

3 讨 论

世界范围内，宫颈癌是一种较常见的妇女疾病，女性恶性肿瘤中排第2位，发病率高达187／1000000，其中超过85.00%的感染者存在于发展中国家［4-5］。大量的流行病学研究表明HPV的持续感染在宫颈癌变中扮演着重要的角色。HPV-DNA检测呈阳性的妇女患上宫颈癌症风险高于呈阴性的妇女50 倍［6］。HPV感染已成为最常见的性传播疾病之一，调查显示，至少有50.00%的人一生中至少感染1次生殖器HPV，美国每年大约有26 万人在45 岁之前就感染过HPV［4］。HPV的分布具有地域差异性，各地区感染率相差很大，世界范围内［7］非洲感染率为22.10%，中美洲和墨西哥为20.40%，欧洲8.19%，我国各地的报道显示［8-11］，北京57.10%，湖南44.45%，福建36.10%。本研究中，HPV感染率为30.80%，与其他地区研究有一定差异，这可能是HPV分布的地域差异性，也可能不同研究者选择的目标人群和研究方法不同引起的。从各年龄段HPV感染情况看，≤25、≥46 岁年龄段显著高于其他年龄段，不同年龄段HPV感染率呈现出“U”形曲线，与聂芳妹等［9］报道相似。

HPV亚型的分布具有地域差异性，不同亚型的致病能力不同。因此，对HPV筛查的分型显得至关重要。本研究中，高危型HPV的感染率为61.67%，低危型感染率为21.23%，高低危亚型混合感染率为17.10%，显示重庆地区HPV的感染以高危型感染为主。高危型HPV感染率排在前6位的为HPV58（10.34%）、HPV16（10.24%）、HPV52（10.09%）、HPV56（6.49%）、HPV33（5.66%）、HPV18（4.56%），低危型感染率前3位的为HPV6（10.70%）、HPV43（7.31%）、HPV11（4.60%），这一结果与本地区的其他报道［9，12］有一定程度程度的差异，究其原因，可能是HPV亚型分布在重庆地区的一个真实表现，也有可能是研究者所选的研究对象、研究标本数量以及研究方法之间存在一定程度的差异引起的。

重庆地区不同年龄HPV亚型单重感染和多重感染构成比中，单重感染是HPV感染的主要形式，这可能是HPV感染的一个特点，与国内报道一致［9-11］。各年龄段多重感染患者中，以二重感染为主，≤25 岁年龄段的三重和四重感染率显著高于其他年龄段。在45 岁之前，多重感染率的分布呈下降趋势，46 岁以后多重感染有所回升，这可能与女性青春期和更年期机体内环境变化有关，这2 个时期机体免疫力和激素水平都有所变化，可能会造成对HPV病毒的免疫力下降。提示，在进行HPV筛查时，应重视这2 个年龄段的人群。

［1］ Clifford GM，Smith JS，Plummer M，et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide：a meta-analysis［J］.Br J Cancer，2003，88（1）：63-73.

［2］ Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide［J］.J Pathol，1999，189（1）：12-19.

［3］ Hubbard RA.Human papollomavirus testing methods［J］.Arch Pathol Lab Med，2003，127（8）：940-945.

［4］ Steben M，Duarte-Franco E.Human papillomavirus infection：epidemiology and pathophysiology［J］.Gynecol Oncol，2007，107（2 Suppl 1）：S2-5.

［5］ Bosch FX，De Sanjose S.Chapter 1：Human papillomavirus and cervical cancer-burden and assessment of causality［J］.J Natl Cancer Inst Monogr，2003，31：3-13.

［6］ Muooz N1，Bosch FX，de Sanjos éS，et al.The causal Link between human papillomavirus and invasive cervical cancer：A population-based case-control study in Colombia and Spain［J］.Int J Cancer，1992，52（5）：743-749.

［7］ De Sanjos éS，Diaz M，Castellsagu éX，et al.Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology：a meta-analysis［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（7）：453-459.

［8］ 杨英捷，赵健，李雪倩，等.2285例女性下生殖道人乳头状瘤病毒感染筛查结果分析［J］.中国实用妇科与产科杂志，2006，22（6）：444-445.

［9］ 聂妹芳，李登清，黄民主，等.11461例妇科门诊患者HPV亚型感染状况的研究［J］.中国现代医学杂志，2011，21（27）：3434-3438.

［10］ 钟伟明，黄善忠，韦干芬.HPV病毒与宫颈癌的研究进展［J］.中国社区医师：医学专业，2011，17（2）：95.

［11］ 杨赟平，杨双双，张莉萍.重庆地区妇女高危型HPV感染现状及年龄的分层分布［J］.重庆医学，2013，42（3）：249-250，254.

［12］ 杨君，周德平，陈凤娴，等.重庆地区2497例妇科就诊患者HPV感染状况分析［J］.重庆医科大学学报，2012，37（4）：347-349.