霍奇金淋巴瘤细胞SHP1表达与CD99表达的关系＊

雷翔慧，汤 瑶，吴自勍，赵 彤△

（1.南方医科大学基础医学院病理学系，广州510515；2.南方医科大学中西医结合医院病理科，广州510515）

SH2 结构域酪氨酸磷酸化酶（SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-l），主要表达于造血细胞的细胞质，是白血病、淋巴瘤细胞的抑癌基因，其异常表达与淋巴瘤的增殖、分化、凋亡有密切关系，表达缺失会导致淋巴瘤的发生［1-3］。霍奇金淋巴瘤（hodgkin lymphoma，HL）是淋巴造血系统的一类肿瘤，SHP1 表达在HL 情况，尚未见文献报道，国外和本课题组之前研究发现HL的发生与CD99 蛋白表达缺失密切相关，CD99表达缺失是H L形成的一个重要分子事件［4-5］，但SHP1表达与CD99表达的关系如何，非常值得探讨，为此本文在以往研究基础上，检测SHP1 在HL中的表达及其与CD99 的作用关系，探讨SHP1 表达在HL中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与细菌B 淋巴母细胞株IM9 细胞、浆母细胞株KM3 细胞、HL 细胞株L428 细胞和L428-CD99（上调CD99 的L428 细胞）细胞，由南方医科大学病理学系保存。采用澳洲进口胎牛血清（无需额外灭活），RPMI-1640 培基配制成含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，37 ℃恒温，5%CO2培养箱中孵育。

1.1.2 试剂与材料RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自南美洲Gibeco 公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF和BCA-100 蛋白质定量测定试剂盒购自凯基公司；β-ac t in 抗体、二抗购自北京中衫金桥生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒购自碧云天公司，试剂盒组成：30% AcroBis、1 mo L Tris-Hcl（p H 8.8）、10%SDS、过硫酸铵、TEMED、1 mo L Tris-Hcl（p H 6.8）；SDSPAGE 蛋白上样缓冲液（5 ×）、蛋白预染Marker、PVDF膜、脱脂奶粉购自广州斯佳公司；Beyo ECL Plus 发光试剂盒购自凯基公司。人SHP1抗体购于美国CST公司，CD99抗体购于Epitomic 公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR（RT-PCR）Trizol、RT-PCR提纯试剂盒、逆转录试剂盒（日本Takara 公司），7500Software v2.0.1，引物构建于Invitrogen 公司，GAPDH上游引物：5′-ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT-3′，下游引物：5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′；CD99上游引物：5′-GCC CAG CAA CAA GCA AAG CAC AT-3′，下游引物：5′-CCC AAC CAC CCT AGT TCC TCC G-3′92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃退32 s 40 s；SHP1上游引物：5′-ATC TGA GGC TTA GTC CCT GAG C-3′，下游引物5′-CTG AGG TCT CGG TGA AAC CAC-3′，92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃32 s 40 s。20μL体系。

1.2.2 Western blot 检测 Western blot 培养的细胞收集各样本蛋白（蛋白裂解液购自碧云天），SDS-PAGE电泳：配置10%浓度的分离胶，5%的积层胶；取50μg 蛋白质与5 ×SDSPAGE 蛋白上样缓冲液混合上样量，积层胶80 V 30 min，分离胶100 V 120 min；冰浴下转膜100 m A 120 min。5% TBST封闭1.5～2.0 h；SHP1 兔抗人单抗（1∶2000 稀释），CD99 兔抗人单抗（1∶5000 稀释），4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5000稀释）室温孵育1 h，荧光成像仪内曝光。

1.2.3 荧光共聚焦实验6 孔板培养L428 细胞48 h，再用无血清培养24 h，收取对数生长期的细胞，细胞悬液密度为1 ×106个／mL，1000 r／min，离心5 min，细胞沉淀0.01 mol／L，PBS 洗涤2～3 次；1000 r／min，离心5 min，弃去上清液；95%乙醇固定15 min，Triton X-100 破膜10 min。0.01 mol／L PBS洗涤3 次，5min，3% H2O28min，0.01mol／L PBS洗涤3 次，5 min，血清封闭5 min，甩去血清，分别用鼠抗人CD99、SHP1抗体孵育，4 ℃过 夜；0.01 mol／L PBS洗涤3次滴加相应的二抗，37 ℃避光孵育30 min；PBS 冲洗；DPAI 复染，观察拍照。

1.2.4 Si-RNA片段瞬时干扰6 孔板细胞培养，细胞密度为1 ×106个／mL，实验组加入10μL干扰片段＋240μL OPTIIMEN，静置20 min，240μL OPTIIMEN＋10μL Lip2000，混合后静置20 min，加入细胞中；对照组加入500μL 培基；37 ℃孵育，分别于48、72 h 进行细胞相关检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件进行分析；采用两个独立样本的非参数检验进行组间比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 L428、IM9、KM3 淋巴瘤细胞SHP1和CD99 mRNA表达IM9中SHP1 mRNA高表达，而KM3、L428细胞中SHP1 mRNA表达较低；且与CD99 的表达趋势相一致，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 RT-PCR 检测IM9、KM3、L428 细胞中SHP1 和CD99 m RNA表 达

2.2 L428细 胞 和L428-CD99细 胞SHP1 mRNA表 达L428-CD99 细胞较L428细胞SHP1 mRNA表达要高，且与CD99 的表达趋势相一致，且差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

2.3 L428、L428-CD99、IM9、KM3 淋巴瘤细胞SHP1 和CD99蛋白表达Western blot 结果与m RNA基因表达水平相一致，IM9、KM3、L428-CD99 细胞中SHP1 表达较L428 细胞中高，且与CD99 的表达趋势相一致。见图3。

图2 RT-PCR 检测L428-CD99（L99）与L428 细胞株中SHP1 与CD99 m RNA的表达

图3 Western blot 检测IM9、KM3、L428、L428-CD99中SHP1 与CD99 的蛋白水平表达

图4 在L428 细胞中荧光共聚焦检测CD99 与SHP1 的表达

图5 瞬时干扰CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表达

2.4 L428 细胞CD99 与SHP1 的表达及其共定位 采用荧光共聚焦实验在L428细胞中检测CD 99与SHP 1的表达部位，同时对其进行共定位，结果显示CD99 主要表达于细胞膜，SHP1 主要表达于细胞质，紫色为共定位部分。见图4。

2.5 瞬时干扰CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表达 在IM9 细胞中Si-RNA瞬时干扰CD99 后，用RT-PCR及Western blot 检测SHP1 在基因和蛋白水平的表达。结果发现下调CD99 后，SHP1 m RNA表达降低（图5A、B），且差异有统计学意义（P＜0.01）；蛋白水平表达趋势与基因水平相一致（图5C）。

3 讨 论

SHP1 主要表达于造血细胞的细胞质，是调节细胞内磷酸化水平的关键调控因子，在多数淋巴瘤和白血病细胞系（如NK-YS2、IWA3、MT1、EDS、ATLIK等）中低表达，其启动子高甲基化状态导致的基因沉默是淋巴瘤、白血病发生、发展的重要机制之一［6-7］。相反，SHP1蛋白在正常细胞中可以表现为正常表达或过度表达。SHP1 调节机能障碍可导致细胞的过度增长，从而导致肿瘤的发生［8-9］。HL是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤，1832年由英国的Thomas Hodgkin 最早描述，该疾病的典型形态特点是在大量的炎性反应背景细胞中浸润少数的肿瘤性H／RS（hodgkin／reed-stern-berg）细 胞［5-10］。人CD99（Mic2）是一种相对分子质量为32 ×103的跨膜糖蛋白，是HL 的潜在致瘤基因，参与造血细胞的分化等。研究报道H／RS 细胞的形态特征及免疫表型的变化与CD99蛋白表达缺失有关，CD99 是HL 形成的一个重要机制［11］。本研究荧光共聚焦检测也发现SHP1 为细胞质表达，CD99 为细胞膜表达，且二者有共定位部分。

Oka 等［12］通过表达谱芯片及组织微阵列技术证实SHP1基因在恶性淋巴瘤中表达明显下降。本研究在转录和翻译水平检测3 株B 系淋巴细胞IM9、KM3、L428 中SHP1 的表达，结果显示SHP1 在HL细胞株L428 中表达最低；与CD99 的基因和蛋白水平表达趋势有一致性。

JAK／STAT信号转导途径参与细胞增殖、分化、凋亡生物学作用的相关调控。研究发现，该途径异常激活是HL 形成的一个重要分子机制，但其异常激活的具体机制尚未完全明确［13-14］。SHP1 基因为存在于细胞质中的一种酪氨酸磷酸酶，是JAK／STAT信号转导途径负性调控因子之一。SHP1 基因沉默可以导致JAK／STAT信号转导分子活性增强，从而促进肿瘤发生、发展。本研究在课题组前期构建的上调CD99 稳定细胞株L428-CD99 中同样在转录和翻译水平检测SHP 1 基因和蛋白水平的表达，发现SHP1 随着CD99 的上调而基因和蛋白水平表达升高。证实SHP1 在HL 中低表达可能与其CD99缺失有关，荧光共聚焦实验以及在IM9细胞株中瞬时干扰CD99 时，均 发 现CD99与SHP 1有相互关系。而CD 99与SHP1 的相互关系是否与SHP1 基因表达下调从而导致JAK／STAT信号转导途径失调有关，有待于进一步研究。

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