RASSF1A基因启动子甲基化在胃癌中的检测意义

孟凡勇，马俊英，陈 萍

（漯河医学高等专科学校第三附属医院普外科，河南漯河462002）

肿瘤是引起目前人类死亡的主要原因，其中胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来随着生活方式和膳食结构的改变，其发病率呈现逐年增加、发病年龄趋向年轻化的趋势［1］。胃癌发生、发展经历了由量变到质变、渐变到突变的连续发展过程，期间涉及到癌基因的激活或者抑癌基因的失活，表观遗传学修饰可以调控基因的表达，DNA甲基化是一种基因主要的表观遗传学修饰形式［2］，近期的研究显示抑癌基因启动子的过度甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制，Ras 相关结构域家 族 基 因1A （ras associated domain family gene 1A，RASSF1A）是近年来已经确认的一个抑癌基因，本研究检测了胃癌患者RASSF1A基因启动子甲基化的情况，以探讨其与胃癌的关系，以期为胃癌的早期预防及分子靶向治疗提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集漯河医学高等专科学校第一、第二、第三附属医院2003年2月至2013年10月保存的200例胃癌患者的胃癌组织蜡块，其中，男124例，女76例，年龄41～77 岁，平均（64.2±12.3）岁，所有病例均经病理确诊为胃腺癌，均行胃癌根治术。另取30例胃溃疡切除患者的正常胃壁组织作为对照，所有病例均经病理确诊未见肿瘤组织，其中，男19例，女11例，年龄39～76 岁，平均（63.1±11.8）岁。两组患者在性别、年龄、临床资料方面差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 组织蜡块DNA提取试剂盒购自美国基因公司，DNA甲基化修饰试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，RASSF1A基因启动子甲基化检测引物和甲基化特异性PCR（MSP-PCR）反应试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，琼脂糖购自上海康利生物科技技术有限公司。9700 PCR仪购自美国ABI 公司，电泳槽购自北京六一仪器厂。

1.2.2 RASSF1A基因启动子甲基化的检测 调取石蜡包埋组织标本，严格按照DNA提取试剂盒的说明书操作提取各个标本的基因组DNA，DNA甲基化修饰试剂盒对基因组1μg DNA进行亚硫酸盐修饰，使用甲基化以及非甲基化引物进行MSP-PCR反 应，RASSF1A甲基化引物，正向：5′-GGG TIT TGC GAG AGC GCG-3′，反向：5′-GCT AAC AAA CGC GAA CCG-3′；RASSF1A非甲基化引物，正向：5′-GGT TTT GTG AGA GTG TGT TTA G-3′，反向：5′-CAC TAA CAA ACA CAA ACC AAA C-3′。MSP-PCR反应体系为25μL，MSPPCR反应条件，95 ℃预变性5 min；95 ℃60 s，65 ℃30 s，72℃30 s，扩增35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。RASSF1A基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果判读：甲基化引物未见条带、非甲基化引物见条带为未甲基化，其余为甲基化，甲基化阳性率（%）＝（甲基化阳性数／总例数）×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS12.0 统计软件处理数据，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌RASSF1A基因启动子的甲基化变化 胃癌患者200例癌组织中检测到74例RASSF1A基因启动子甲基化，阳性率为37.0%；对照患者30例正常胃壁组织中检测到4例RASSF1A基因启动子甲基化，阳性率为13.3%，RASSF1A基因启动子甲基化阳性率在胃癌组织显著高于正常胃壁组织（P＜0.05）。见图1。

图1 RASSF1A基因启动子甲基化的MSP-PCR 检测

2.2 胃癌患者RASSF1A基因启动子甲基化变化与临床指标的相关性分析 将胃癌患者根据肿瘤临床分期、有无淋巴结转移和肿瘤分化程度进行分组，结果显示胃癌患者RASSF1A基因启动子甲基化阳性率在临床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移和中、低分化的患者分别为46.2%、47.7%和48.7%，显著高于临床Ⅰ、Ⅱ期，无淋巴结转移和高分化患者的27.1%、28.6%和29.8%（P＜0.05）。见表1。

表1 胃癌患者RASSF1A基因启动子甲基化变化与临床指标的相关性分析

2.3 患者随访情况 术后随访1年，74例RASSF1A基因启动子甲基化胃癌患者复发12例，复发率为16.2%，对照患者复发7例，复发率为5.6%，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

表观遗传学是指细胞分裂增殖过程中DNA序列不改变，但一系列的DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等的参与，影响相关基因表达的一门学科［3-5］。其中，DNA甲基化作为表观遗传学中的一个重要内容最受重视，其在肿瘤的发生、发展、复发、预后评估的价值已经得到了证实［6-7］。DNA甲基化机制是S-腺苷甲硫氨酸上的活性甲基在DNA甲基转移酶作用下的化学修饰过程，转移至胞嘧啶的第5 位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，因此可以设计特异性的引物区分出甲基化的状态［8-9］，使用甲基化的特异性引物。本研究发现了胃癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化的阳性率显著高于对照正常胃壁组织，说明RASSF1A基因启动子甲基化参与了胃癌的致病过程。RASSF1A基因是一个抑癌基因，可以通过多种途径抑制细胞生长和促进细胞凋亡，例如其可以阻断JNK通路，下调细胞周期素1 等抑制肿瘤细胞的生长，DNA甲基化在调控染色体结构和基因表达方面发挥着重要作用，抑癌基因启动子Cp G岛的甲基化，可以失活相应基因的表达［10-13］。由此可以间接推断出RASSF1A基因启动子甲基化可以失活RASSF1A基因，参与胃癌的发生过程。

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，本研究观察到胃癌患者RASSF1A基因启动子甲基化阳性率在临床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移和中、低分化的患者显著高于临床Ⅰ、Ⅱ期，无淋巴结转移和高分化的患者。得出RASSF1A基因启动子甲基化可能参与了胃癌的发生、发展以及侵袭转移过程。

综上所述，本研究显示胃癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化，可能参与了胃癌的发生、发展过程，并有可能作为胃癌分级、预后评估的新指标。由于本研究未检测RASSF1A基因的表达情况，其启动子甲基化是否真正影响基因表达尚无直接的证据，具体的调控机制还有待进一步的研究证明。此外，DNA甲基化是一种可逆的变化，目前，已有5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-Cd R）去甲基化处理治疗恶性肿瘤的报道［14-15］，针对RASSF1A基因启动子的去甲基化治疗，有可能成为胃癌的一个潜在治疗靶点，相关方面的研究将会对肿瘤的治疗和预后发挥积极的作用。

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