原发性三叉神经痛基因治疗的实验研究进展

秦泗佳 王福 张奎启 高璐 金海威

原发性三叉神经痛有临床症状但无与发病有关的器质性或功能性病变，阵发性剧痛是其疼痛特点，且疼痛的程度随病程的延长而加重，疼痛发作的频率也会逐渐增加。原发性三叉神经痛发病率约8/10万，平均发病年龄(62.7±15.8)岁，据临床症状可将其分为典型和不典型[1]。随着社会生活水平的提高，人的寿命不断延长，高龄人群不断增多，该病的发病率也逐渐增高[1]。因其病因和发病机制尚未明确，所以尚无成熟可靠的治疗方法。主要的治疗方法有药物、手术、放射、中医、基因和其他疗法等，每种方法各有利弊。近年来采用基因手段治疗三叉神经痛成为研究的热点，本文着重从基因治疗方面对近年来国内外相关的实验研究作一综述。

一、基因治疗疼痛的原理及技术

1.基因治疗疼痛的原理

基因治疗疼痛是通过上调抗痛基因或下调疼痛基因的表达来实现的。前者通过基因重组技术将抗痛基因、调控因子基因和疼痛相关受体基因插入到转运载体，再将重组的载体导入中枢神经系统内，作用于初级传入神经和脊髓背角；后者利用反义寡核苷酸下调神经内源性疼痛基因的表达或下调疼痛作用位点：蛋白激酶C、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和神经调节素1受体等。近年来的研究发现三叉神经痛发作时，相关的神经递质的产生会出现变化，提示可通过相关载体介导产生这些神经递质的基因靶向导入靶组织，通过改变相关递质的水平达到镇痛目的。

2.基因治疗疼痛的技术

主要的技术手段有基因的修复、置换、失活、修饰和免疫调节等。基因修复是指依照正常的基因结构修复异常的基因使其恢复正常的基因结构；将正常的基因导入到突变的细胞内替换掉病变的基因称为基因置换；利用反义寡核苷酸技术和RNA干扰(RNAi)技术有针对性地封闭病变的基因称为基因失活；利用各种技术将所需的目的基因导入到病变的细胞中并进行表达以改善或弥补病变细胞的相关功能称为基因修饰；将目的基因导入到患者的体内，以改变患者的免疫功能称为免疫调节。

二、基因治疗疼痛的主要内容

基因治疗疼痛主要包括：镇痛基因的选择；镇痛基因的扩增、测序；镇痛基因转移载体；镇痛基因靶组织的选择；镇痛基因表达的调控；试验疗效及安全性评价等。目前的研究多集中在镇痛基因的选择、镇痛基因转移载体和镇痛基因表达的调控等方面，故还需要加强对其它方面的研究。

1.镇痛基因

镇痛基因主要有阿片肽类、细胞因子类和RNAi。

阿片肽类主要包括脑啡肽、β-内啡肽、孤啡肽、内吗啡肽和强啡肽5种，其作用机制是通过与体内的阿片类受体相结合抑制疼痛信息的传递[1]。①1975年脑啡肽在猪脑中被发现，主要包括甲硫氨酸脑啡肽和亮啡肽两种，它对δ受体有较强的选择性，多种抑制性神经递质可经其介导的阿片受体作用产生镇痛效果。在大鼠鞘内注入含有人前脑啡肽原基因的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体可转染大鼠中枢神经细胞，并在该细胞内有效表达重组的脑啡肽基因，产生明显的镇痛效果。以慢病毒作为载体也同样有良好的镇痛效果。②β-内啡肽的镇痛效果要比脑啡肽强，能直接与脊髓的μ受体和ε受体结合，使脑啡肽的分泌增多从而产生更强的镇痛效果。在大鼠鞘内注入含有人β-内啡肽基因的重组腺病毒后，大鼠脑脊液内β-内啡肽浓度明显增高。③孤啡肽的氨基酸序列与强啡肽相似，它的受体是一种孤儿受体，广泛分布于神经系统内。在脑室内注入微量的脑啡肽就能使大鼠的痛阈降低，还可抑制吗啡的抗伤害镇痛效应，但其作为目的基因还需要大量的基础研究结果支持。④内吗啡肽对μ受体有高度的选择性，其亲和力强，主要分布在脑和脊髓。将内吗啡肽注入到脑和脊髓的蛛网膜下隙可产生明显的镇痛效果，其对于炎性疼痛和神经痛有明显的镇痛效果，最适宜用于顽固性疼痛的治疗，但目前的研究均只采用直接注射的方法，此法易产生耐受。⑤脑和脊髓的神经元中均能分泌强啡肽，其在脊髓的作用复杂，正常水平时就能起到镇痛的效果，在神经受损后，脑脊液中的水平明显升高。因其在脊髓痛觉调控中具有双重调控作用，所以目前还没有将其应用于疼痛基因治疗的研究。

细胞因子类主要包括免疫调节性细胞因子和神经营养因子两大类。①免疫调节性细胞因子主要以抑制神经组织的炎症反应或类阿片肽的作用来治疗疼痛，主要包括IL-2和IL-10。将含有能表达人源IL-2的重组腺病毒注入大鼠脑脊液内，在大鼠的软脊膜和各段脊髓实质中能检测到人源IL-2 mRNA的表达，说明注射能表达人源IL-2的重组腺病毒对慢性神经病理性疼痛具有明显的镇痛效果。将含人IL-10基因的慢病毒载体经鞘内注射后，坐骨神经慢性压迫(CCI)模型大鼠痛觉异常明显缓解，其脊髓、脑皮质和海马中的IL-10表达上调。②神经营养因子可以促进特定神经组织细胞的分化与再生，还可刺激神经递质的释放和改变神经元特性。神经营养因子主要包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白4、神经营养蛋白3和神经生长因子等，多用于神经损伤或中毒导致的慢性神经痛。黄爱苹等[2]将慢病毒载体介导的BDNF基因与电针对神经病理痛模型大鼠痛阈的影响进行比较，认为BDNF 参与了大鼠痛敏的过程，BDNF的表达有利于受损神经修复。

RNAi是利用一种小片段干扰性双链RNA作为效应分子，催化与靶基因mRNA结合的级联反应，从而减少mRNA的含量。RNAi主要通过细胞内正义链的聚合酶链反应大量扩增干扰性RNA来干扰目的基因的表达。RNAi在植物及非脊椎动物的应用中已有较多的研究报道，但在哺乳动物中尚未见成功的报道。

2.基因转移载体

基因转移载体主要有病毒载体和非病毒载体。

病毒载体主要利用病毒包膜蛋白的识别作用将外源基因转到宿主细胞内，主要包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体和慢病毒载体，相关病毒载体的比较可参见文献[3]。病毒载体的主要缺点是存在自身免疫原性和可能造成细胞的病理改变等。①腺病毒(AV)载体与单链逆转录DNA病毒载体能高效地感染分裂和非分裂细胞。腺病毒载体能够介导谷氨酸转运蛋白(GLT-1)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、钾离子通道Kir2.1、β-内啡肽、IL-2、IL-10和IL-24等，该载体经鞘内注射后主要感染脑膜细胞，这说明该载体可有其他的特异性靶细胞[4]。②腺病毒载体经修饰后即为AAV，它的免疫原性比腺病毒低，不导致炎症的发生或产生抗体。AAV有多种血清型，不同血清型的趋向性与注射的途径有关，鞘内注射能感染60%的背根神经节(DRG)神经元，皮内注射时感染率远低于30%[5]。2009年Towne等报道将以AAV为载体且能表达针对电压依赖性钠离子通道Na(v)1.3的小发卡RNA的病毒注射入DRG可减轻保留神经损伤(SNI)模型诱导的病理性疼痛。③HSV有两条DNA链，有嗜神经性，感染感觉神经末梢后能逆向转运到神经元胞体，从而减少给药的次数和不良反应，应用前景良好[6]。HSV载体可介导脑啡肽原、γ-氨基丁酸、氨基脱羧酶和TNF-α，其中TNF-α是一种炎性因子，在神经病理性疼痛调控中起重要作用。用HSV介导TNF-α能减轻大鼠脊神经结扎神经病理性疼痛引起的疼痛行为。目前表达人的前脑啡肽原的HSV载体已应用于临床Ⅰ期试验，将其接种在皮下可减轻癌症引起的疼痛[7]。④慢病毒载体的优点是能容纳大片段的基因且免疫反应小，而且能感染非分裂期的细胞。通过构建携带含下游调控元件的拮抗分子(DREAM)基因短发夹干扰RNA的慢病毒载体，然后注入到坐骨神经缩窄损伤的大鼠体内，发现慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰脊髓中DREAM的表达, 说明此法可用于神经病理性疼痛的治疗。

非病毒载体因其诸多优点而受到广泛的关注。非病毒载体主要有细胞载体、脂质体和质粒等。①细胞载体具有取材和培养简便、易转染、高表达且无排斥等优点，动物实验中显示有较好的镇痛效果[8]。早期多使用肿瘤细胞，现在多使用神经干细胞、骨髓间充质细胞和造血干细胞等。因宿主抗外源细胞免疫反应，所以可采用生物材料将细胞微囊化，以降低免疫反应的程度。②脂质体主要包括中性、阴离子和阳离子脂质体，因中性和阴离子脂质体自身带有很大的缺点，所以应用受限。阳离子脂质体自身带有正电荷能够与带有负电荷的细胞膜进行融合，从而利用胞吞作用形成内涵体的形式介导DNA进入到细胞内。由于带有正电荷，在血液循环中能与带负电荷的血清蛋白吸附，形成聚集体而被网状内皮系统清除，造成其血液循环时间短、转染率低。针对此缺点，现已研发了基于可离子化阳离子脂质的脂质体，称为稳定的核酸-脂质粒子[9]。该粒子在血液中易与载脂蛋白结合，易被肝细胞吸收，具有很好的肝靶向[10]。Yu等[11]则合成了不同亲水头和疏水尾的可离子化阳离子脂质用于小干扰RNA的传递，效果显著。Tabernero等[12]的研究发现核酸-脂质粒子能很好地抑制肝肿瘤的生长和转移。③质粒的结构简单且易制备，无免疫反应，也是一种常用的非病毒载体。

3.基因转染的靶向性

基因转染主要以神经元和神经元周边的脑膜细胞为靶细胞。通过外周皮肤或黏膜注射及神经核团定点注射的靶细胞为神经元；通过脑脊液内注射的靶细胞为神经元周边的脑膜细胞。以抗痛基因的过表达为靶点主要有：阿片肽前体、神经营养因子和细胞因子等；以减少疼痛基因的表达为靶点主要有：蛋白激酶C、GTP环化水解酶1、NMDA受体和电压依赖性钠离子通道Na(v)1.3[6]。已有学者研究发现，在偏头疼中枢敏感化过程中，蛋白激酶Cε膜转位增加[13]。NMDA受体的2B亚基是参与疼痛调节的主要亚基，截肢前阻断疼痛刺激能够抑制中枢神经系统NMDA受体2B亚基的激活，阻止术后迁延性疼痛的发生[14]。

4.基因治疗表达的调控

我们可以在不同水平调节基因治疗，现有的研究多集中在动物模型中，临床应用研究还较少，需行进一步的探索研究。Wolfe等于2009年报道，他们在完善的临床前期准备后将HSV基因载体用于治疗顽固性癌痛患者，观察其临床镇痛效果和不良反应，发现阻碍其临床应用的问题在于相关载体和基因产物的安全性，也应注意如何提高其表达效率和血脑、血神经屏障通过率。通过电针能增强慢性炎症疼痛大鼠背根神经节牛肾上腺髓质22肽的表达，并增强其非阿片受体(感觉神经元特异性受体)和阿片受体(μ阿片受体、δ阿片受体)mRNA的表达[15]。

5.基因治疗疗效及安全性评价

疗效的评价主要是在动物模型上体现的，现有的建立三叉神经痛动物模型的方法主要有以下几种：慢性缩窄环模型、三叉神经末梢致痛模型、牙髓灌注模型、三叉神经根埋植模型、经颞下窝暴露三叉神经节模型、经枕骨下暴露三叉神经根模型和经颞下暴露三叉神经节模型[16]。然后运用感觉测试器在不同的时间节点观察动物模型的行为反应和疼痛阈值的变化，以此来判断基因治疗的疗效。

基因治疗的安全性主要涉及到载体和基因产物两方面。若为病毒载体往往具有一定的神经毒性，AAV的毒性最小，而非病毒载体一般没有毒性。基因的过度表达会造成神经系统功能的紊乱，过少又往往达不到预期的治疗目的，因此关键还在于调控机制是否得当。

三、总结与展望

原发性三叉神经痛发病机制未明，虽有多种治疗方法，仍不能达到理想效果，今后应更深入地研究其机制，探索治疗该病的更安全有效的疗法，深入研究基因治疗的可行性。治疗应采用个性化的治疗方案，可结合多种疗法。同时注重提高患者的生活质量，加强患者的心理治疗，消除抑郁、悲观情绪，使其能更好地配合治疗。随着生物治疗技术的发展，基因治疗已成为药物、手术、放射和中医中药治疗之后的又一种治疗手段，若有合适的载体和基因，在保证安全性的基础上，基因治疗将在原发性三叉神经痛的治疗中发挥重要的作用。

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