血管新生与冠心病治疗性血管生成

张少言 林赟霄 陈浩 综述 王佑华 审校

(上海中医药大学附属龙华医院，上海200032)

冠心病是当代威胁中老年健康的疾病之一，是造成中老年人死亡的重要原因。随着冠状动脉支架等冠状动脉再通术的开展，严重心肌梗死患者的缺血心肌受到很大的益处，但是其术后再狭窄率较高。近些年来，由于药物涂层支架及新型抗凝药物的广泛应用，冠状动脉支架术后再狭窄率已显著降低，但国外一些大规模的临床试验表明，药物涂层支架仍存在5%左右的再狭窄率[1]。另外，其对于晚期心肌梗死患者的病死率作用较小(BRAVE-2和TOSCA-2研究);对于稳定型心绞痛患者与药物治疗比较没有优势(COURAGE研究)。因此，促进心肌缺血区域的侧支循环形成和血管新生在当前冠心病的治疗策略中显得尤为重要。至此，治疗性血管新生成为了治疗冠心病的另一个新靶点。

1 血管新生及其影响因素的实验研究

广义的血管新生涉及血管发生、血管新生以及动脉生成这三个主要的过程。血管发生是指胚胎发育过程中血管从无到有的过程，主要是指内皮祖细胞(EPC)从骨髓迁移的过程;血管新生是指在原有的毛细血管基础上通过血管内皮细胞的增殖与迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生的形式生成新的毛细血管的过程;动脉生成是指在已经生成的小动脉基础上形成管径更大的侧支循环。

影响血管新生的有关因素综述如下。

1.1 促血管新生因子

1.1.1 血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(VEGF)家族主要包括胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及血小板源性生长因子，能特异性地作用于血管内皮细胞并刺激它增殖。

Freitas-Andrade等[2]探讨了 PIGF 在缺氧时引起的脑血管生成方面的潜在作用，结果发现PIGF+/+的动物7 d后血管生成有了40%的显著增长。

VEGF-A主要是通过结合血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1和VEGFR-2来调节内皮细胞增殖、迁移和促血管新生的。VEGFR-1对血管生成主要起着负性作用，而VEGFR-2对促血管生成的信号表现出强大的酪氨酸激酶活性。Kendrew等[3]用VEGFR-2抗体阻断VEGFR-2信号通路后，血管新生数目也显著减少了。VEGFR-1的基因不仅编码全长型mRNA受体，而且还编码一种短的可溶性mRNA受体(sFlt-1)，而可溶性sFlt-1具有内源性VEGF抑制剂的功能[4]。

Bry等[5]发现，VEGF-B不能诱导显著的毛细血管生成，对通透性的增加和聚集炎症细胞到缺血组织也没有益处。可见，VEGF-B似乎有一个相对有限的血管生成活性。

VEGF-C与其受体VEGFR-3结合后，能直接诱导血管芽生和肿瘤血管生成[6]。

VEGF-D是一种分泌型糖蛋白，实验发现，它能诱导胆囊癌血管生成[7]。

研究发现，VEGF-E在促进血管生成的治疗中可能比VEGF-A更有用，角蛋白14-VEGF-A的转基因小鼠在增加血管生成的同时表现出严重的炎症和水肿[8]。

1.1.2 成纤维细胞生长因子

成纤维细胞生长因子(FGF)家族由22个相关多肽组成，其中如FGF1和FGF2，具有强效的血管生成活性。最近，Frontini等[9]利用基因芯片技术分析发现，在血管成熟过程中，FGF9在血管平滑肌细胞被高度上调。其作用是促进血管肌化，但不是促进内皮细胞增殖或血管新生。

1.1.3 低氧诱导因子

当心肌缺血缺氧时，低氧诱导因子(HIF)1-α被激活。在有氧条件下，HIF1-α被脯氨酰羟化蛋白酶和HIF抑制因子羟化后失活。实验发现，脯氨酰羟化蛋白酶和HIF抑制因子基因双敲落的小鼠，HIF1-α表达被上调，增加了EPC的动员和促进了血管新生[10]。HIF-2α是HIF-1α的同源体，也能直接激活基因表达来编码一些促血管生成因子，如VEGF和血管生成素[11]。Skuli等[12]发现，HIF-1α 和 HIF-2α 在促血管新生中具有互补的作用。在内皮细胞HIF-2α缺陷的小鼠，结果也观察到了血管形成，但是这些血管不能经历正常的动脉生成，导致了组织区域低灌注。所以，HIF-2α也是血管新生必不可少的一个组织因子。HIF-3α4是HIF-3α的剪接变体，研究发现，它能够与HIF-1α形成转录复合物，阻止HIF-1α与低氧反应元件的结合，导致VEGF的转录水平显著受到抑制，显示出一种负性调节机制[13]。

1.1.4 胰岛素样生长因子-1

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种与胰岛素结构相关的肽类激素，在EPC培养基中，IGF-1通过抗细胞凋亡和促血管新生效应介导强有力的心肌修复作用，而IGF-1的中和抗体组对心肌梗死后心脏结构和功能的改善却没有影响[14]。

1.1.5 转录生长因子-β

转录生长因子-β(TGF-β)超家族主要包括33个成员，如TGF-βs、骨形成蛋白和activins等。有关小鼠和人类的遗传研究揭示，TGF-β通路在血管发育和维持血管稳态中扮演着举足轻重的作用。缺乏TGF-β信号元件的小鼠由于血管缺陷，在胚胎期就死亡了;TGF-β受体突变的患者，血管发育异常，易患遗传性出血性毛细血管扩张症、肺动脉高压等[15]。TGF-β1和VEGF都能诱导血管新生，但对血管内皮细胞的效应却是相反的。VEGF保护血管内皮细胞，而TGF-β1诱导其凋亡[16]。

1.2 祖/干细胞

1.2.1 EPC

Rufaihah等[17]将 CD133+EPC移植到心肌梗死大鼠，结果发现，大鼠的成熟血管密度增加了将近3倍，心肌梗死面积也显著减少了。但是，EPC的作用机制和“身份”识别仍旧是悬而未决的[18]。因为EPC表面抗原不同，其对血管新生的作用也不尽相同。

1.2.2 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞(iPS)能分化成各种心血管细胞，在一个体外后肢缺血模型中，iPS分化成血管内皮细胞后促进了血管新生[19]。但是，这里仍然存在一些问题[20]，如iPS随机整合到宿主细胞的致畸性;iPS分化成有功能的心肌细胞仍然是相对缓慢，效率低下的。

1.2.3 其他

其他的EPC还有脂肪组织干细胞、骨髓间充质干细胞(MSC)、骨髓源性的祖细胞(BMC)等。

1.3 小分子RNA

小分子RNA(miRNA)是一些短段的(20～25个核苷酸)非编码RNA，通过结合靶信使mRNA，能够调节基因的表达，导致翻译抑制或降解。研究发现，不同的miRNA对血管生成效应的影响不同。如miR-424(322)[21]等的上调，miR-126(115)[22]等的下调都具有血管生成效应。

1.4 内皮型一氧化氮合酶

实验发现，内皮型一氧化氮合酶被激活后释放一氧化氮，可以调控平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，促进EPC的迁移和存活，介导血管新生[23]。

1.5 炎症细胞及因子

一些炎症细胞主要包括单核细胞和中性粒细胞，也能作用于血管新生。在小鼠，单核细胞主要包括两种亚型:Ly6Chi和Ly6Clo。心肌缺血发生后，它们先后渗透到缺血区域。Ly6Chi主要在心肌损害早期，具有吞噬、蛋白水解和炎症的功能;Ly6Clo则发生在晚期，具有减轻炎症反应和表达VEGF的作用。Nahrendorf等[24]认为，Ly6Clo通过分泌 VEGF来促进血管生成，而且两种亚基的任何一种匮乏都会阻碍心肌梗死后新生血管的形成。相反，Cochain等[25]认为是Ly6Chi，而不是Ly6Clo，促进后肢缺血模型的血管新生。因此，单核细胞亚基促血管新生的作用还需进一步的研究和澄清。

在体外角膜模型，中性粒细胞的耗竭显著性减少了炎症性血管新生[26]。

另外，一些炎症分子如单核细胞趋化蛋白-1，肿瘤坏死因子-α，白介素-1β和白介素-8也能够促进血管新生[27]。

2 冠心病治疗性血管新生的临床研究

结合血管新生的影响因素，治疗性血管新生主要分为蛋白生长因子治疗、基因治疗、细胞治疗和miRNA。

2.1 蛋白生长因子治疗

使用生长因子类蛋白的治疗是治疗性血管新生的第一种探索。两种最常用的生长因子是VEGF和FGF。但是，它们并没有产生强大的治疗效果，而且存在剂量依赖性，可能的解释是蛋白质的生物半衰期过短。

2.2 基因治疗

基因治疗是指将生长因子基因转移到心肌组织，进而通过诱导生长因子的产生来促进血管的生长。用于治疗性血管新生的基因往往与蛋白治疗中使用的生长因子都是相同的。但是，基因治疗能保持一个长期的疗效。其中的一个瓶颈是关于基因载体的问题。目前使用的载体有质粒、脂质体和病毒载体。而质粒的低转导率，脂质体的免疫原性和炎性，逆转录病毒通常只转导分裂细胞，而心肌细胞通常不是一个有较高速度的有丝分裂细胞，都存在很大的局限性。腺病毒恰好避免了上述问题，目前被大家所接受。但是，临床上有关基因治疗效果的报道却是不一致的。Kalil等[28]在13例顽固性心绞痛患者的心肌内注射phVEGF165，数据表明患者的症状和心肌灌注得到了改善。而NORTHERN试验[29]纳入了93例3级或4级心绞痛症状的患者，结果发现2 000 μg的VEGF165基因治疗组和安慰剂组在心肌灌注的3个月或6个月后并没有差异。

2.3 细胞治疗

细胞治疗主要是充分挖掘干细胞的修复和再生能力。这种方法的优点是不仅可以更换损坏的心肌细胞，而且也分泌一些因子促进原来的心肌细胞改善它们的功能。最近关于干细胞移植的临床试验进展很快，主要包括BMC和MSC，但结果也不尽如人意。Assmus等[30]研究发现，2年后BMC组的累积终点死亡事件、心肌梗死的再发率和血运重建率都显著低于安慰剂组，BMC治疗对心肌梗死后心功能恢复可能至少持续2年。而最新一项关于BMC的临床试验结果表明，ST段抬高性心肌梗死患者经成功的再灌注治疗后，冠状动脉内无论是早期还是晚期(5～7 d或3～4周)注入BMC在随后的4个月内对左室功能的改善都没有意义[31]。关于MSC的移植，临床报道也不一致。Jazi等[32]临床试验证明MSC的移植能改善心肌梗死后心功能，增加左室射血分数。而另一项关于ST段抬高性心肌梗死后MSC注入的临床随机试验却表明，MSC组与控制组的左室射血分数在6个月、12个月和24个月后并没有发现任何的差异[33]。

2.4 miRNA

虽然体外实验已证实不少miRNA表达的上调或下调能够促进血管新生，但是目前还没有通过临床试验研究miRNA的治疗性血管新生作用。

鉴于上述单个治疗方法效果不佳，联合治疗策略在体内外实验已得到开展。一项Td/FGF1-EPC实验[34]，即把FGF1基因转导给体外培养的 EPC，证实了两者的联合使用对血管新生具有更强大的促进能力。Foubert等[35]评估了EPC和平滑肌祖细胞的联合治疗，结果显示毛细血管和小动脉密度在联合治疗组的提高优于单独使用。所以，联合治疗策略在一定程度上增加了血管新生的概率，其在临床上的治疗效果，也需要我们进一步地探讨。

3 结语

目前，在心绞痛或心肌梗死的临床试验中，治疗性血管新生的疗效报道尚不尽一致、是相互矛盾的。但随着实验研究进一步地探讨和完善，临床经验的总结，miRNA的兴起和联合治疗策略的开展，其在冠心病的治疗中仍然是一个很有前途的战略，将为不适合现有疗法的冠心病患者提供新的策略。

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