食管癌微转移检测技术及其临床应用研究进展

曾 薇 综述 李惠武 审校

(新疆医科大学附属肿瘤医院1肺内科一病区, 2肿瘤研究所; 3新疆医科大学科研中心, 乌鲁木齐 830011)

食管癌位于世界常见恶性肿瘤的第8位，其治疗模式的选择基于美国癌症联合委员会(AJCC)制定的食管癌TNM分期系统[1-3]。虽然目前以手术为主的化放疗辅助综合治疗使食管癌患者的预后有了明显的改善，但总体患者的1年生存率仅为75%左右[4]，术后5年生存率仅为20%～30%[5]，仍有许多患者死于肿瘤的局部复发和远处转移[6-7]。 目前研究证实，食管癌患者的不良预后与肿瘤微转移有关[8-9]。所谓肿瘤微转移(micrometastasis)是指非血液系统恶性肿瘤在发展过程中，播散并存在于血液循环、淋巴道、骨髓及各组织器官中的肿瘤细胞，但尚未形成转移性结节，且无任何临床表现，常规病理学、影像学等方法难以发现和检测到的一种微量转移特征[10]。

近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展，已开发出各种应用于肿瘤微转移检测的先进技术，并正在不断完善，逐步走向临床。本文就食管癌微转移检测的常用技术、标记物及微转移检测的临床意义进行分析和整理综述如下。

1 食管癌微转移检测的常用技术

1.1苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE) 使用HE染色法检测肿瘤微转移，主要是通过观察细胞的形态学改变来辨别肿瘤细胞。HE染色可显示正常和病变组织的一般形态结构，便于长期保存、阅读。但是，由于显微镜检查的主观性强，受到病理学医师技术水平的影响大，且因多核细胞的存在以及隐匿性微转移灶直径较小使得细胞学检查难度增大。Nagatani 等[11]分别采用HE染色、IHC法检测CK表达，RT-PCR检测SCC mRNA表达，来判断22例食管癌的33枚气管旁淋巴结中肿瘤细胞的转移。结果发现HE染色法检测食管癌淋巴结转移的阳性率为50%，IHC法检测阳性率为33.3%，RT-PCR技术为83.3 %；其中有1枚淋巴结使用HE染色法检测呈阳性，但IHC法及RT-PCR技术检测均呈阴性，提示在诊断淋巴结微转移时，使用IHC法/RT-PCR技术结合HE染色进行分析，可降低检测的假阴性率[11]。

1.2免疫组织化学技术(immunohistochemicaltechniques,IHC) 目前，细胞角蛋白家族(cytokeratins, CKs)已成为最广泛应用于免疫组织化学检测技术的上皮性标记物[12]。免疫组织化学技术已广泛应用于冰冻或石蜡包埋淋巴结中微转移的检测，与HE染色相比，具有更好的敏感性。但是，不同实验中心在免疫组化技术上的差别可能导致检测结果的差异。为改变这一现况，许多国际组织提出标准化免疫组化实验技术，以利于更多前瞻性研究结果的评价[12]。Bagheri 等[13]采用IHC法对43例食管癌肋骨骨髓中CK的表达进行检测，结果发现,有13例患者骨髓中CK表达呈阳性(30.2%)，提示存在骨髓微转移；进一步分析显示，患者骨髓微转移与肿瘤组织学分级和肿瘤纵隔淋巴结转移显著相关。Koenig等[14]采用IHC法检测73例食管癌HE染色阴性淋巴结中AE1/AE3的表达，结果显示,有25例患者淋巴结中AE1/AE3表达呈阳性(34.25%)，提示存在淋巴结微转移；进一步分析显示，淋巴结微转移阴性患者的5年生存率优于微转移阳性患者，二者比较差异有统计学意义(76% vs 30%，P=0.021)。提示食管癌淋巴结微转移与患者的不良预后相关。

1.3RT-PCR技术(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction) RT-PCR技术通过检测组织中特定mRNA标记物来证实肿瘤细胞的存在，其中一些RNA标记物如CK18、CK19、CK20、MUC1和CEA，已经被作为评估上皮来源恶性肿瘤微转移的特异性分子标记物[15]。RT-PCR技术检测微转移的敏感性可达10-6～10-7，较IHC技术和HE染色法高。但是，针对某些肿瘤标记物呈低水平表达或在转录过程中表达下调的问题，许多研究机构提出通过多中心实验来界定检测标记物的阳性参考值，并积极开展多种标记物联合检测的RT-PCR技术[15]。Altomare等[16]采用RT-PCR技术对68例pN0期、62例pN1期食管腺癌淋巴结中CK19、CK20、CEA和TACSTD1的表达进行检测，并以53例食管良性病变的淋巴结作对照。结果显示，68例pN0期食管腺癌中有30例患者淋巴结中至少有1种标记物表达呈阳性(44%)，提示存在淋巴结微转移；62例pN1期食管腺癌中有40例患者淋巴结中至少有1种标记物表达呈阳性(65%)，提示存在淋巴结微转移；术后随访2 a发现，pN0期食管腺癌淋巴结中存在3～4种标记物阳性表达者的总生存期和无病生存期显著差于标记物均呈阴性表达者，差异具有统计学意义(P<0.05)。Sun等[17]采用RT-PCR技术检测82例pN0期食管癌淋巴结中MUC1 mRNA的表达。结果显示，23例患者淋巴结中MUC1 mRNA呈阳性表达(28.1%)，提示存在淋巴结微转移；多因素分析显示，淋巴结微转移、原发肿瘤大小是影响pN0期食管癌患者术后淋巴结复发、转移的独立因素。

1.4其他检测方法Western-blot是从蛋白质水平来检测食管癌的微转移，还结合了肿瘤细胞特异性抗原抗体染色反应，因此其检测肿瘤蛋白质的特异性和敏感性均很高；肿瘤细胞培养可将患者可疑微转移的组织或体液进行克隆培养，使其增殖后再进行肿瘤细胞的检测；生物芯片技术(biochip或bioarray)是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。生物芯片技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化微转移诊断的新技术[18]；蛋白质组学(proteomics)可从蛋白质即生物功能执行者入手，动态、整体、定量地研究肿瘤转移过程中蛋白质种类、数量的变化，从细胞或组织蛋白质整体水平来探讨肿瘤的微转移[19]。

2 食管癌微转移检测的常用标记物

自1869年，Ashworth首先报道了1例肿瘤患者外周血中存在癌细胞以来，肿瘤微转移的概念在实践中逐步得到认识并成为近年来肿瘤转移研究的热点。目前常用于食管癌微转移的分子标记有以下几类。

2.1粘蛋白基因粘蛋白基因(MUC1)位于人染色体lq21-24区域，含有7个外显子，其包括6个成员(mucin 1、2、3、4、5a、5b)，编码上皮组织细胞膜上粘蛋白的核心蛋白。MUC1基因广泛分布于正常食管黏膜，以及食管鳞癌、食管腺癌和Barrett食管黏膜中。正常情况下，覆盖在食管黏膜表面的粘蛋白是保护黏膜层避免胃酸、胃蛋白酶等有害物质侵蚀的第一道屏障，其表达水平会随胃酸、胃蛋白酶刺激作用而升高[20]。但是，MCU1基因的过表达则与食管腺癌发生、食管癌淋巴结转移密切相关[21]。Li等[22]采用RT-PCR技术对93例pN0期食管癌淋巴结中MUC1 mRNA的表达进行检测。结果显示，有32例患者淋巴结中MUC1 mRNA的表达呈阳性(34.41%)，提示存在淋巴结微转移；淋巴结中MUC1 mRNA阴性表达者的无病生存期、5年生存率显著优于阳性表达者，差异有统计学意义(P<0.05)，多因素分析显示，淋巴结微转移是影响患者预后的独立因素。

2.2细胞角蛋白家族细胞角蛋白家族(cytokeratins, CKs)主要存在于上皮细胞胞浆中，是构成细胞骨架的一类中间丝状物。根据CKs相对分子质量和等电点的不同，现在已知CKs由20个成员组成，即CK1～CK20。虽然CKs已广泛应用于上皮来源恶性肿瘤微转移的检测，但是一些上皮来源恶性肿瘤中也存在某些CKs的表达缺失，这就可能导致检测结果出现假阴性，所以选取适当种类的CKs抗体或联合其它标记物进行检测尤为重要。由于上皮组织恶变后，其表达的细胞角蛋白与正常组织基本相同，所以检测间质组织如骨髓、外周血、淋巴结中细胞角蛋白的表达被广泛应用于上皮来源恶性肿瘤微转移的诊断[23]。Marjanovic等[24]采用IHC法检测70例pN0期食管癌根治术后患者淋巴结中CK的表达。结果显示，有16例患者的淋巴结中CK表达呈阳性(23%)，提示存在淋巴结微转移；淋巴结中CK呈阴性表达者的5年生存率显著优于阳性表达者，差异具有统计学意义(54% vs 30%，P<0.02)；多因素分析显示，淋巴结中CK的表达是影响患者预后的独立因素。

2.3癌胚抗原癌胚抗原 (CEA)最早在1965年由Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现，其编码基因位于19号染色体，编码分子量为22 ku的糖蛋白。CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原，正常情况下，CEA经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的CEA则进入血液和淋巴循环，使得食管癌患者的血清CEA水平升高。Imamura等[25]采用RT-PCR技术对35例食管癌患者术后淋巴结中CEA mRNA的表达进行检测。结果显示，淋巴结中CEA mRNA的阳性表达率为55.5%，提示存在淋巴结微转移；进一步分析显示，CEA mRNA的阳性表达与肿瘤浸润深度、淋巴结显性转移、血管受侵显著相关，提示对于淋巴结中CEA mRNA呈阳性表达者除了需要在术中充分地清扫淋巴结外，还应在术后给予全身性辅助治疗。Tanaka等[26]采用RT-PCR技术对244例食管癌根治术后患者外周血中CEAmRNA、SCCmRNA的表达进行检测，并定义外周血中只要检测到1种肿瘤标记物mRNA呈阳性表达即可诊断存在微转移。结果显示，有41例患者外周血中至少检测到1种肿瘤标记物mRNA呈阳性表达(16.8%)，提示存在外周血微转移；进一步分析显示，患者外周血中微转移与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、血管受侵显著相关；多因素分析显示，外周血微转移是影响患者术后无病生存期的独立因素。

3 食管癌微转移检测的临床意义

目前研究证实，肿瘤微转移检测可用于精确临床分期、判断患者预后及预测肿瘤复发转移的风险[7]。通过对微转移分子生物学特性的探讨，可以为肿瘤发生、发展、转移的生物学研究提供新的见解和理念，使研究者能够更好地理解肿瘤转移的复杂生物学过程，有利于发现抗肿瘤转移治疗的新靶点，指导患者的临床治疗。同时，在现阶段临床肿瘤学研究中，急需实时监测每位患者抗肿瘤治疗效果的生物标记，而新兴的肿瘤微转移研究则有着巨大的潜力来填补这一空白[12]。

3.1精确临床分期Jiao等[8]使用胸/腹腔镜对106例食管癌患者的331枚淋巴结进行活检，在常规病理学检查阴性的280枚淋巴结中，使用IHC法检测CK的表达。结果显示，有11枚淋巴结(3.9%)中CK表达呈阳性，提示存在淋巴结微转移，并因此有3例患者(4.3%)的临床分期由N0上调至N1。

3.2预后判断微转移对患者预后的影响仍在进一步研究中，但是一些小型、单中心的研究已给出了阳性结果[27]。 Prenzel等[28]采用IHC法对48例食管癌HE染色呈阴性淋巴结中AE1/AE3的表达进行检测。结果显示，有7例患者淋巴结中AE1/AE3表达呈阳性(14.6%)，提示存在淋巴结微转移；进一步分析显示，淋巴结微转移阳性患者的5年生存率显著低于阴性表达者，差异有统计学意义(57% vs 82%，P=0.02)；多因素分析显示，淋巴结微转移是影响食管癌患者预后的独立因素。

3.3复发转移的预测Takeuchi等[29]采用PCR技术对82例pN0期食管癌淋巴结中MUC1 mRNA的表达进行检测。结果发现，有23例患者的淋巴结中MUC1mRNA呈阳性表达(28.1%)，提示存在淋巴结微转移；多因素分析显示，淋巴结微转移是影响pN0期食管癌患者术后淋巴结复发、转移的独立因素。

3.4指导临床治疗对于术后患者来说，监测术后外周血中微转移可为每位患者的随访提供个体化的临床信息；对于辅助化疗后的患者来说，监测化疗后外周血中微转移可帮助患者识别肿瘤复发风险，并使部分患者从二线治疗中获益；对于术前患者来说，通过现有的手段提高淋巴结中微转移的检出率，可以使人们对食管癌的淋巴结转移模式有更深刻的理解，使早期食管癌患者(pN0)进行个体化、有选择性的前哨淋巴结清扫成为可能，以期最大限度地减少患者的手术创伤，利于患者的术后恢复[30]。

总之，在今后工作中，微转移检测可能成为改善肿瘤患者预后的一个有价值的工具，根据微转移的生物学特征指导患者实施个体化的临床治疗将成为可能。但是微转移检测在应用于临床实践工作之前，仍有一些关键性问题有待解决。一是需要进行多中心试验规范微转移的检测技术,界定微转移检测标记物的参考值；二是微转移检测在判断患者预后、预测肿瘤复发转移风险中的价值，需要大型、多中心的临床试验验证；三是目前存在10%～50%的肿瘤显性转移患者外周血标本中微转移检测呈阴性，分析具体原因可能为微转移病灶未表达所使用的检测标记物，以及微转移病灶中检测标记物的表达水平低于检测水平。因此，改进微转移的检测平台，如使用芯片技术，可能在后期研究中克服这些问题[15]。

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