2，5 -己二酮致大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的研究

严明锦，陈若霖，朴丰源

(1.解放军第210 医院 护理部，辽宁 大连116021;2.大连医科大学 劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁 大连116044)

正己烷作为有机溶剂，广泛应用于机械清洗、工业粘胶配制及电器制造等产业领域。由于正己烷易于挥发，当人们长期暴露于正己烷时，可导致以感觉运动型多发性周围神经病为主要临床特征的慢性中毒［1］。代谢研究表明，2，5 -己二酮(2，5 -HD)是正己烷体内代谢产物，是诱导神经毒性的终毒物［2］。文献报道，2，5 -HD 可诱导多种组织细胞的凋亡。然而其诱导机制尚不清楚。

间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新分化能力和多向分化潜能的成体干细胞。目前已成为组织和器官修复学领域的研究热点。近年来，把MSCs 作为一种新的体外细胞模型来研究细胞毒性，引起广泛关注。一些文献已经报道，铅、砷等外源化合物可诱导MSCs 凋亡［3-4］。但有关2，5 - HD 暴露对MSCs 凋亡影响的研究，尚未见报道。本文用2，5 -HD 作为受试物，大鼠骨髓MSCs(BMSCs)作为体外细胞模型，就2，5 -HD 对BMSCs 的凋亡作用及其作用机制进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

(1)SD 大鼠BMSCs:取4 ～6 周龄SD 大鼠股骨骨髓，体外培养及纯化获得;(2)主要试剂:L -DMEM 培养基(Gibco BRL 公司);胎牛血清(NQBB公司);胰酶(sigma 公司);SD 大鼠BMSCs 成脂诱分化培养基、SD 大鼠BMSCs 成骨诱导分化培养基(广州赛业公司);流式FITC-CD29 抗体、PE-CD45 抗体、PE-CD90 抗体(e -BIOSCIENCE 公司);HE 染色试剂盒(中杉金桥);hoechst 33342(sigma 公司);兔抗大鼠Bax，Bcl -2 一抗(CST 公司)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥);辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥);IX -70 型倒置显微镜(Olympus公司);MCO-15AC 型CO2 孵育箱(SANYO 公司);流式细胞仪(BD 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BMSCs 的提取及原代培养:选用4 ～6 周龄健康SD 大鼠，脱臼处死，无菌分离股骨、胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并用PBS 反复冲洗，收集骨髓细胞，200 目铜网过滤制成单细胞悬液，用含12%胎牛血清LG -DMEM 重悬细胞，以接种细胞于塑料平皿中，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中孵育，并标记为原代(P0)。72 h 首次换液，以后每3 d 换液1 次，于显微镜下观察细胞生长状况和形态特征。

1.2.2 BMSCs 传代培养:原代细胞80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 比例传代培养，直到贴壁细胞接近融合，再重复上述操作，反复传代扩增，并标记为P1～P5代等。

1.2.3 BMSCs 的鉴定:流式细胞仪检测大鼠BMSCs 表面抗体阳性标志物CD29 为90.10%和CD90为96.61%，阴性标记物CD45 为0.40%。所提取细胞可向成骨细胞和脂肪细胞分化。提示，这些细胞为大鼠BMSCs(此部分结果未在本文中显示)。

1.2.4 实验分组:将大鼠BMSCs 分为4 组，即10 mmol/L、20 mmol/L 和40 mmol/L 2，5 -HD 染毒组及只给treat 液的对照组(含2% 血清的LG -DMEM)，培养24 h。

1.2. 5 细胞活性检测:取培养至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接种于24 孔板中，每组设3 复孔。染毒24 h 后去除原培养液，用PBS 冲洗3次。加入含12%血清L - DMEM 500 μL/孔，加入MTT 50 μL/孔。置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中孵育4 h。轻轻吸弃原培养液，加入750 μL/孔的DMSO，37 ℃反应10 min，吸取此培养液，加入96 孔板中，每孔100 μL。每组设3 复孔，酶标仪测定492 nm 吸光度值。

1.2.6 HE 染色:取培养至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接种于24 孔板中，染毒24 h后去除原培养液，用PBS 冲洗3 次，加苏木精染色5 min，去除苏木精，PBS 冲洗3 次。加伊红5 min，去除伊红，PBS 冲洗3 次。倒置显微镜下观察并拍照记录。

1.2.7 hoechst 染色:取培养至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接种于24 孔板中，染毒24 h 后去除原培养液，用PBS 冲洗3 次。将带有Hoechst 染料的treat 液(终浓度为10 μg/mL)，加入到24 孔板中，37 ℃避光反应20 min。荧光显微镜下观察，紫光激发。

1.2.8 Western Blot 分析:采用BCA 比色法试剂盒测定裂解液中蛋白质的浓度，将30 μg 总蛋白加入4 Loading buffer，95 ℃煮沸5 min 后，经15%分离胶行SDS-PAGE 电泳，并以预染蛋白maker 为标志，判定电泳终止时间。60 V 恒压将样品转至硝酸纤维素滤膜上，时间为2 h;于5%的脱脂奶粉室温封闭1 h;TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加入1∶500小鼠抗大鼠β - actin(或1 ∶400 兔抗大鼠Bax，或1∶400兔抗大鼠Bcl -2 单克隆抗体)，4 ℃孵育过夜;TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加入1∶5 000 辣根酶标记的山羊抗小鼠抗体(或1∶4 000 辣根酶标记的山羊抗兔抗体)，37 ℃孵育2 h;TBS -T 洗膜3次，每次10 min;ECL 化学发光显影。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS13.0 进行One - Way ANVOA 分析，实验数据用均数±标准差表示，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs 的培养

BMSCs 初始分离时，大小不一，多数呈圆形或椭圆形，72 h 后部分细胞贴壁，呈短梭形、多角形等多种形态，当细胞融合至80% ～90% 后传代(图1A)。细胞传代后生长速度明显加快，24 h 后基本完全贴壁，第3 代后细胞基本为多角形、梭形，形态均一，呈漩涡状或簇状排列(图1B)

图1 BMSCs 的形态学观察Fig 1 MorphologyofBMSCs

2.2 2，5 -HD 对BMSCs 活力影响

各实验组BMSCs 存活率显著低于对照组(P ＜0.05)，且其存活率随着2，5 -HD 浓度的升高而下降(图2)。

2.3 HE 染色观察

HE 染色结果显示，对照组BMSCs 呈梭形或多边形，并有较长的神经突起;各实验组BMSCs 变圆，部分细胞皱缩，胞体变小，胞核固缩，贴壁能力减弱，且随2，5 -HD 浓度的增大，这种细胞形态变化更加明显(图3)。

图2 2，5 -HD 暴露BMSCs 活力Fig 2 Viability of BMSCs exposed to 2，5 -HD

图3 2，5 -HD 暴露BMSCs 的形态学变化(HE 染色×100)Fig 3 Morphologic changes of BMSCs exposed to HD (HE staining×100)

2.4 Hoechst 染色观察

在荧光显微镜下经紫外激发，可见正常细胞的核呈均匀的蓝色荧光;而在各实验组，部分BMSCs可见细胞核呈现核固缩和新月形等典型的细胞凋亡形态学改变(如图4箭头所示)，且随2，5 -HD 浓度的升高具有这种特征的细胞增多(图4)。

图4 2，5 -HD 暴露BMSCs 的凋亡特征性形态变化(Hoechst 染色×200)Fig 4 Morphologic changes of apoptotic BMSCs(Hoechststaining×200)

2.5 2，5 -HD 对BMSCs Bax 和Bcl-2 蛋白表达影响

检测结果表明，2，5 -HD 染毒BMSCs 的Bax 蛋白表达水平显著高于对照组(P ＜0.05)，且随染毒剂量的增加而升高，呈现剂量反应关系(图5A)。而染毒组BMSCs 的Bcl-2 蛋白表达水平则显著低于对照组(P ＜0. 05)(图5B)。染毒组BMSCs 的Bax 与Bcl -2 的蛋白表达比值显著高于对照组(P ＜0.05)(图5C)。

图5 5 -HD 暴露BMSCs 的Bax 和Bcl-2 蛋白表达Fig 5 Expression of Bax and Bcl-2 proteins in BMSCs exposed to HD

3 讨 论

一些研究提示，2，5 - HD 可诱导组织细胞凋亡［5-6］。本研究结果显示，2，5 - HD 暴露导致了BMSCs 活力显著下降，呈现核固缩和新月形等典型细胞凋亡形态学改变的BMSCs 增多，与上述文献报道一致。这些结果提示，2，5 -HD 暴露诱导BMSCs凋亡。

细胞凋亡是由于细胞受内外因素刺激，触发其本身的死亡程序而导致的，一种主动且由凋亡相关蛋白严格调控的细胞自我消亡过程［7］。Bax 和Bcl-2是已发现的重要凋亡调控相关蛋白。Bax 发挥促凋亡作用，而Bcl -2 发挥抗凋亡作用，二者作用的调控整合决定细胞的生死［8-9］。本研究结果显示，2，5 -HD 染毒BMSCs 的Bax 蛋白表达水平显著高于对照组，而Bcl-2 蛋白表达水平则显著低于对照组，且Bax/Bcl-2 蛋白表达比值呈现剂量依赖性升高。Sun Y 等［5］和Ogawa 等［6］研究发现，2，5 -HD 诱导神经细胞及卵巢颗粒细胞Bax 表达上调和Bcl-2 表达下调，与本研究结果一致。这些结果提示，2，5 - HD 暴露诱导BMSCs 凋亡可能与Bax/Bcl-2 蛋白表达紊乱有关。今后有必要对2，5 -HD 暴露BMSCs 凋亡通路下游调控蛋白的表达变化，进行进一步研究。

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