亚慢性砷暴露对小鼠小脑组织甲状腺激素受体表达的影响

田晓刚，张 璇，冯和玺，白 洁，朴丰源，关 怀

(1.解放军第210 医院 妇产科，辽宁 大连116021;2.铁岭卫生职业学院 医学营养系，辽宁 铁岭112000;3.大连医科大学劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁大连116044)

慢性砷中毒损伤高级神经系统功能，主要表现为学习记忆能力下降，在流行病学调查和动物实验中均得到证实［1］。然而，砷的神经毒作用机制至今不清。研究表明，长时程记忆(long -term memory，LTM)是学习记忆的生物学基础［2］;砷对实验动物学习记忆功能的影响与其干扰突触可塑性、损伤LTM有关［3］。本研究组前期工作显示:砷暴露可显著抑制小鼠脑中诱发LTM 的重要蛋白激酶Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin -dependent protein kinase Ⅳ，CaMKⅣ)基因、蛋白的表达以及学习记忆相关基因c -Fos，JunB 的表达，并伴有LTM 形成抑制以及小鼠的运动学习能力下降［4］。那么，砷又是如何抑制CaMKⅣ的表达呢?研究表明，CaMKⅣ基因的转录和翻译受一个复合体调控，甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor，TR)是这个复合体的关键成员，而TRα1、TRβ1 和TRβ2 是TR 的3 个功能性受体［5］。因此，本研究假设砷通过TR/ CaMKⅣ通路介导其神经毒作用。

另外，近年的文献报道，小脑除参加运动功能外，也在运动性学习记忆中发挥重要作用［6］。慢性砷中毒小鼠出现小脑神经元损伤以及运动性学习记忆障碍［4，7］，提示砷导致学习记忆下降可能与小脑损伤有关。本研究组的前期工作也证实砷暴露小鼠小脑组织CaMKⅣ蛋白表达受到抑制，其抑制程度与砷暴露剂量呈明显正相关［4］。因此，本研究采用差异表达基因谱芯片筛查亚慢性砷暴露小鼠小脑组织TR 相关基因的差异表达，Real -time RT -PCR和Western blot 技术从基因和蛋白水平进行验证，以期为砷的神经毒作用机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 主要试剂:染毒试剂三氧化二砷(As2O3)、硝酸(HNO3)、过氧化氢(H2O2)(Sigma，美国);焦碳酸二乙酯(DEPC -Water)(美国Ambion 公司);TR Izol 试剂盒(美国Invitrogen 公司);RNA 纯化试剂盒(RNeasy Mini Kit)(德国OIAGEN 公司);RNA 反转录试剂盒(Prime Script TM RT Master Mix)(TaKa-Ra，中国);兔抗小鼠多克隆TRα1 抗体(Abcam，美国)、兔抗小鼠多克隆TRβ1 抗体、小鼠抗小鼠单克隆TRβ2 和β-actin(SANTA CRUS，美国)。

1.1.2 主要仪器:WX -Ⅱ型小鼠跳台自动控制仪(中国医学科学院药物研究所，中国);全自动芯片洗涤工作站450、基因芯片杂交箱640(Affymetrix 公司，美国);HC-2518R 高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，中国);Real -time PCR检测仪(Thermo Cycler Dice Real Time System TP800)(TAKARA 公司，日本);DYCZ -240 型垂直板电泳槽(北京六一仪器厂，中国);DYY -12 型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂，中国);酶标仪(Thermo Electron Corporation，美国);UVP 凝胶成像系统(UVP 公司，美国)。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组及处理:SPF 级昆明种小鼠40 只，雌雄各半，体重(20 ±2)g，购自大连医科大学实验动物中心。按体重将小鼠随机分为4 组，每组10只，雌雄各半，根据其饮水As2O3浓度，分别为0 mg/L(对照组)、1 mg/L、2 mg/L 和4 mg/L(染砷组)。普通饲料，自由采食。饲养室温度(22 ±3)℃，湿度40%左右。连续染毒60 d，先行为学实验，后脱颈法处死小鼠，取小脑组织，-80 ℃冻存。

1.2.2 行为学实验—跳台实验:先将小鼠放于电跳台箱内适应5 min，以消除探究反应。底部铜栅通电(36 V)，小鼠在受电刺激中逐渐学会跳上平台回避电击。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又重新跳回平台，训练5 min，24 h 后将小鼠置于平台上，铜栅通电。观察小鼠第1 次跳下安全台的潜伏期、5 min 内小鼠跳下平台的错误次数。若小鼠停留在平台上超过5 min，其潜伏期以300 s记录。

1.2.3 差异表达基因谱芯片制作及数据分析:从对照组、2 mg/L 和4 mg/L 染砷组随机选取小脑样本。TRIzol 法提取总RNA，纯化，分光光度计定量，质检，反转录合成cDNA;体外转录合成cRNA 探针，生物素标记;生物素标记的cRNA 探针经片段化处理后与Mouse Genome 430 2.0 Araay 基因芯片在杂交箱640 中45 ℃杂交16 h，然后于全自动芯片洗涤工作站450 中洗脱、染色;最后用GeneArrayT M 扫描仪3000 扫描杂交信号。杂交结果采用Microarray Suite Version 5.0 分析软件(Affymetrix 公司，美国)进行分析。

1.2.4 Real -time RT -PCR 测定TRα 和TRβ 的mRNA 表达:引物设计见表1。TRIzol 法提取小脑组织总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录，总反应体积20 μL，42 ℃45 min 后反转录，85 ℃10 min 灭活反转录酶，-20 ℃保存或立即进行PCR 扩增。PCR 反应条件设定为预变性95 ℃3 min，95 ℃12 s，62 ℃40 s，40 个循环。

表1 TR 基因引物Tab 1 Specific primer sequences for TR genes

1.2.5 Western blot 测定TRα1、TRβ1 和TRβ2 的蛋白表达:预冷组织蛋白抽提试剂，加入Roche 蛋白酶抑制剂及PMSF，配制成裂解液。向各暴露组脑组织中加入裂解液，用眼科剪剪碎后在冰水混合物中用Fluko 电动匀浆器15 000 r/min 匀浆30 s，在冰上孵育20 min，4 ℃13 000 r/min 离心20 min，取上清BCA 法进行蛋白定量。取35 μg 蛋白进行SDSPAGE 电泳，90 V 电泳2 h，电泳结束后湿式转至PVDF 膜35 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，抗体结合:TRα1(1∶500)/IgG(1∶5 000)、TRβ1 (1∶50)/IgG(1∶2 000)、TRβ2(1∶50)/IgG(1∶5 000)、β - actin(1∶400)/IgG(1∶2 500)。ECL 显色发光，UVP 扫描分析，用凝胶图像处理系统分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 亚慢性砷暴露对小鼠学习和记忆能力影响

跳台实验中，随染砷剂量增加，各组小鼠发生错误次数逐渐增加，错误潜伏期逐渐缩短，均呈剂量-反应关系(P ＜0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠跳台实验结果比较Tab 2 Results of step-down test

2.2 亚慢性砷暴露小鼠小脑组织TR 相关基因谱的差异表达

与对照组比较，2 mg/L 和4 mg/L 染砷组小鼠小脑组织TRβ 的基因表达显著下调(P ＜0.05)，随染砷剂量增加下调程度加重;染砷组小鼠小脑组织TRα 的基因表达无显著变化(P ＞0.05)。详见图1。

2.3 亚慢性砷暴露对小鼠小脑组织TRα 和TRβ mRNA 表达的影响

Real-time RT-PCR 检测结果显示，与对照组比较，各染砷组小鼠小脑组织TRα 的mRNA 表达均无显著变化(P ＞0.05);染砷组小鼠小脑组织TRβ的mRNA 表达随染砷剂量增加逐渐降低，组间两两比较，差异均有显著性意义(P ＜0.05)，呈剂量-反应关系。详见图2。

图1 砷暴露小鼠小脑组织TRα 和TRβ mRNA 水平的差异表达Fig 1 The differential mRNA transcription levels of TRα andTRβ in cerebellum of As exposed mice

图2 各组小鼠小脑组织TRα 和TRβ mRNA 表达结果Fig 2 The expression of TRα and TRβ mRNA in cerebellum of mice

2.4 亚慢性砷暴露对小鼠小脑组织TRα 和TRβ蛋白表达的影响

Western-blot 检测结果显示，染砷组小鼠小脑组织TRβ1 的蛋白表达低于对照组，2 mg/L 和4 mg/L 染砷组与对照组比较，差异有显著性意义(P ＜0.05)，并且，4 mg/L 染砷组小鼠小脑组织TRβ1 的蛋白表达也显著低于2 mg/L 染砷组(P ＜0.05);TRα 和TRβ2 的蛋白表达在各组小鼠间比较，差异均无显著性意义(P ＞0.05)。详见图3。

图3 各组小鼠小脑组织TRα 和TRβ 蛋白表达结果Fig 3 The expression of TRα and TRβ protein in cerebellum of mice

3 讨 论

长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)是突触可塑性的主要表现形式，两者相互影响，调控LTM的形成，是学习记忆活动的生物学基础［2］。LTP 强化记忆的形成，LTD 对记忆的内容进行选择、确信、核实、提高相邻突触LTP 诱导的敏感性，进而提高神经网络重建的精细度和灵活性。若改变LTP 或LTD，则破坏了学习的神经网络，进而破坏LTM 的形成。一些文献报道，砷暴露能导致实验动物或斑马鱼的学习、记忆功能降低，其机制可能与砷抑制LTP 的诱导过程及损伤LTM 有关［3］。另有研究表明，酒精、皮质酮等对学习、记忆等认知功能的影响可能与其干扰突触可塑性的另一种形式LTD 的诱导有关［8-9］。提示，包括LTP 和LTD 在内的LTM 通路可能是许多神经毒物损伤性影响学习记忆功能的重要靶部位。探讨神经毒物对LTM 通路干扰的毒作用机制成为当前国内外神经毒理学家们研究的热点。

LTM 的形成和维持依赖于神经元之间突触效能的改变，需要基因转录及新的记忆蛋白合成。当各种刺激信息进入海马等处神经元，促使突触前膜释放递质谷氨酸，后者作用于突触后膜N -甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)，使NMDAR 激活，离子通道开启，大量Ca2+内流，使胞内Ca2+浓度升高。当Ca2+与钙调蛋白(CaM)结合时，活化钙调蛋白依赖蛋白激酶激酶(Calmodulin dependent protein kinase kinases，CaMKK)，CaMKK 进一步磷酸化活化激活CaMKⅣ/cAMP 反应原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等信号途径的一系列级联反应，导致下游学习记忆相关基因的转录和蛋白表达［4］。本研究组前期工作显示:砷暴露小鼠小脑组织CaMKⅣ蛋白表达受到抑制，并伴有LTM 形成抑制以及小鼠的运动学习能力降低［4］。提示，CaMKⅣ是砷抑制LTM 诱导的关键靶点。

CaMKⅣ基因的转录和翻译是由三碘甲腺原氨酸(T3)与甲状腺激素受体(TR)-视黄醇类X 受体(RXR)异二聚体(TR-RXR)结合而特异性介导的，此复合体的作用位点为CaMKⅣ基因上游启动子的TH 反应原件(TRE)。TRα1、TRβ1 和TRβ2 等三种功能性受体与T3的结合能够解除CaMKⅣ基因启动子TRE 的抑制状态，从而介导CaMKⅣ基因的表达。文献报道，砷能够明显抑制功能性TR 及其介导的基因的表达［10］。本研究中，基因芯片筛选出砷暴露小鼠小脑组织TRβ 基因与对照组表达差异明显;经Real-time RT-PCR 发现，砷暴露对TRβ mRNA 表达有明显抑制作用，且呈剂量-反应关系;经Western blot 发现，砷暴露TR 功能性受体TRα1 和TRβ2的基因、蛋白表达没有显著影响，但对TRβ1 的蛋白表达有抑制作用，尤其在中、高剂量染砷组。本组研究结果表明，砷暴露可能通过抑制TRβ1 的基因、蛋白表达导致异二聚体TR - RXR 减少，其后T3与TR-RXR 结合形成复合体减少，进而，该复合体在CaMKⅣ基因上游与T3结合从而解除启动子抑制状态的作用被削弱，最终，CaMKⅣ基因在转录和翻译水平受到抑制，LTM 过程受损。

本研究证实，砷暴露小鼠学习记忆功能下降，其机制可能与抑制TR 的功能性受体TRβ1 表达，进而损伤LTM 有关。

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