14 -3 -3/Raf-1 复合体介导的榄香烯抗胶质瘤作用

赵印生，赵永顺

(1.辽宁医学院附属第一医院神经外科，辽宁锦州121001;2.大连医科大学附属第一医院神经外科，辽宁大连116011)

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，由于其具有侵袭性生长的特性，使得在神经外科显微手术中很难做到对肿瘤的完全切除，且胶质瘤的级别也随着手术次数和复发次数的增加而增加。近年来，对于低级别胶质瘤大多主张显微神经外科手术尽可能全部切除，对于高级别胶质瘤主张在尽可能全切的情况下，术后结合放化疗，分子靶向治疗等治疗措施。

榄香烯(Elemene)是从中药莪术中提取，主要成分为β-榄香烯，是中国自主开发的国家二类非细胞毒性抗肿瘤新药，国内有学者进行多年的临床实验研究发现，榄香烯具有抑制胶质瘤细胞增殖，诱导胶质瘤细胞凋亡的作用［1-3］。但其对胶质瘤细胞的抗肿瘤作用机制及作用靶点尚未明确，本实验将通过观察榄香烯对人源U87 胶质瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用，以及榄香烯对人源U87 胶质瘤细胞ERK 通路及该通路中关键分子复合体14 -3 -3/Raf -1 的影响，探讨其抗胶质瘤细胞的相关机制。

1 材料和方法

1.1 材 料

2%榄香烯乳剂购自大连金港制药公司;人源胶质瘤U87 细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所;DMEM 培养基购自美国GIBCO BRL 公司;Raf-1、ERK、磷酸化ERK 蛋白质单克隆抗体购自美国Cell Signaling 公司;磷酸化Raf -1(Tyr340/341)、14 -3 -3、β-actin 蛋白质单克隆抗体和Protein A/G PLUS-Agarose 购自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养:将人源胶质瘤U87 培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培养基(青霉素50 U/mL，链霉素50 mg/mL)中，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至对数生长期。

1.2.2 细胞增殖检测:将对数生长期的人源胶质瘤U87 以4 ×105/孔密度接种于6 孔培养板中，培养24 h，分别加入药物浓度为0、20、40、80 μg/mL 的榄香烯，分别培养12、24、36、48 h。然后用胰酶消化，细胞计数仪(Beckman)计数，绘制生长曲线，以榄香烯质量浓度0 μg/mL 为对照组。

1.2.3 免疫共沉淀:(1)取对数生长期的人源胶质瘤U87 以4 ×105/孔密度接种于6 孔培养板中，培养24 h 后，以含榄香烯0、20、40、80 μg/mL 的培养液处理1 h。(2)吸掉培养液，PBS 冲洗2 次(在冰上操作)，每孔加裂解缓冲液RIPA buffer［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，1.0% NP -40，0.25% Na -deoxycholate，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L aprotinin，1 mg/mL PMSF，leupeptin and pepstatin］100 μL，刮除细胞后混匀30 min，12 000 r/min 离心5 min，取各组U87 总细胞裂解液(300 μL)，加入2 μg Raf-1 一抗(anti -Raf -1)混匀置于4 ℃下2 h。(3)加入20 μL 琼脂糖偶联蛋白悬浮液(Protein A/G PLUS -Agarose)，加盖并置于摇床4 ℃下孵育12 h。(4)4 ℃下，1 000 r/min 离心30 min 后收集沉淀物。小心吸去上清，保留沉淀。(5)用RIPA 缓冲液漂洗沉淀5 次。每次漂洗都需重复离心步骤。(6)最后一次漂洗后，吸去上清，用电泳上样缓冲液重悬浮沉淀物，煮浮样品5 min，Western blot 检测。

1.2.4 Western blot 检测:(1)取对数生长期的人源胶质瘤U87 以4 ×105/孔密度接种于6 孔培养板中，培养24 h 后，80 μg/mL 浓度的榄香烯共同孵育1 h。(2)吸掉培养液，PBS 冲洗2 次(在冰上操作)，每孔加裂解缓冲液RIPA buffer［50 mmol/L Tris -HCl(pH 7.4)，1.0% NP -40，0.25% Na -deoxycholate，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L aprotinin，1 mg/mL PMSF，leupeptin and pepstatin］100 μL，刮除细胞后混匀30 min，离心，取上清，分光光度计检测浓度，加入上样缓冲液调至相同终浓度，94 ℃煮5 min。(3)配制10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶，上样，60 V 电泳1 h，然后调至100 V 继续电泳直至溴酚蓝稍跑出，将蛋白从SDS 聚丙烯酰胺凝胶转至PVDF 膜上。(4)加一抗，4 ℃过夜。加二抗，室温1 h。(5)ECL(Amersham)检测，图像定量分析软件(Image Quant 5.2 software，Amersham)分析蛋白条带。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 榄香烯对U87 胶质瘤细胞增殖的影响

榄香烯对U87 胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用，在相同的处理时间内(24 h)，榄香烯抗胶质瘤增殖作用随药物浓度增大而增强(图1A)，在药物浓度为20 μg/mL 时，相对于空白对照具有抗增殖效应，在药物浓度为80 μg/mL 时榄香烯达最大抗胶质瘤效应，其细胞增殖抑制率约为(54. 4 ±1.9)% (P ＜0.05)，其IC50约为(83.2 ±4.3)μg/mL。在相同药物浓度下(80 μg/mL)，榄香烯抗肿瘤效应随着药物作用时间延长而增强(图1B)，其中在36 h 达到最大抗增殖效应，作用时间48 h 与36 h 组间无明显差异(P ＞0.05)。

图1 榄香烯抗U87 细胞增殖效应的浓度、时间依赖特点Fig 1 Dose- and time-dependent anti-glioma effect of elemene

2.2 榄香烯对U87 胶质瘤细胞14 -3 -3/Raf -1分子复合体的影响

与对照组相比，经各药物组处理后的肿瘤细胞中参与形成Raf -1/14 -3 -3 复合物的分子伴侣14 -3 -3 量随药物浓度增大而减少，虽然当浓度为40 μg/mL 时参与形成Raf -1/14 -3 -3 复合物的分子伴侣14 -3 -3 量略高于20 μg/mL 浓度组，但两组间比较差异无显著性意义(P ＞0.05)(图2)。在药物浓度为80 μg/mL 时，Raf-1/14 -3 -3 形成量最少(P ＜0.05)。

图2 榄香烯对U87 胶质瘤细胞14 -3 -3/Raf-1 分子复合体形成的影响Fig 2 Impact of elemene on 14-3-3/Raf-1 complex formation

2.3 榄香烯对U87 细胞ERK 信号通路中关键蛋白表达的影响

榄香烯0、20、40、80 μg/mL 处理U87 细胞1 h后，各处理组间14 -3 - 3 蛋白表达无明显差异(P ＞0.05)，榄香烯对U87 细胞总14 -3 -3 蛋白表达无影响，见图3A。

经榄香烯处理后的肿瘤细胞P-Raf-1 蛋白表达随药物浓度增大而下调，当药物浓度为20 μg/mL时，给药组与对照组无明显差异(P ＞0.05)，当药物浓度增大达40 μg/mL 时P -Raf -1 表达明显下调(P ＜0.05)，并且在药物浓度为80 μg/mL 中达最大抑制效应。见图3B。

经榄香烯处理后的肿瘤细胞磷酸化的ERK 和Raf-1 蛋白表达均随药物浓度的增大而下调(P ＜0.05)，见图3C;但榄香烯对非磷酸化的ERK 和Raf-1 蛋白表达水平无明显影响(P ＞0.05)。榄香烯下调U87 胶质瘤细胞系Raf/MEK/ERK 信号通路关键蛋白表达。

3 讨 论

图3 榄香烯对U87 细胞ERK 信号通路中关键蛋白表达的影响Fig 3 Key proteins expression in ERK signal pathway after treatment by elemene

目前与肿瘤细胞的生长、增殖、转移和侵袭有密切关系的信号通路有MAPK 通路和PI3 K/Akt 通路［4-5］。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen - activated protein kinases，MAPK)信号通路主要包括:Extracellular signal - regulated kinases(ERK1/2)，Jun N -terminal kinases (JNK)及p38MAPK 通路;其中ERK1/2 信号通路调控细胞生长和分化，是将胞外的生长和神经营养信号传到核内的蛋白激酶级联反应中的重要组分;JNK、p38MAPK 信号通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用［6］。

Ras 基因是人类原癌基因中突变率最高的基因，约占30%。在胶质瘤细胞中，Ras 蛋白的活性增加对于MAPK/ERK 通路的激活至关重要［7］。Raf激酶的调控和激活方式如图4所示(RTK 代表受体酪氨酸激酶)，活化型Ras -GTP 复合物结合激活Raf 激酶，后者将信号传递至MAPK 信号通路，14 -3 -3 蛋白是Raf 激酶信号传递调控中重要的蛋白。

图4 Raf 激酶的调控和激活模式［8］Fig 4 The regulation and activation modle of Raf kinase

14 -3 -3 蛋白是细胞中广泛表达的酸性蛋白家族，是细胞中含量最丰富的蛋白之一，最初发现于哺乳动物的神经系统脑脊液中，其在肿瘤形成及发展过程中高度表达具有诱导细胞产生恶性表型，促进癌细胞增殖的作用，使得癌细胞的形态变得更有侵袭性等重要的作用［9-10］。

本实验发现，经过榄香烯处理后，U87 胶质瘤细胞中与Raf-1 结合并形成分子复合体的14 -3 -3蛋白水平下调，榄香烯阻碍14 -3 -3/Raf -1 分子复合体的形成;榄香烯可以下调U87 细胞中磷酸化的Raf-1 和ERK 蛋白表达。由此，推断榄香烯对U87 细胞增殖抑制作用的机制是破坏了14 -3 -3蛋白对Raf-1 的分子结合功能，阻碍U87 细胞14 -3 -3/Raf-1 复合体的形成，使Raf -1 稳定性受到破坏，结构域不能暴露，Raf-1 不能与Ras -GTP 结合，不能被活化。为排除榄香烯使U87 细胞中与Raf-1 结合的14 -3 -3 下调是由于U87 细胞总14 -3 -3 表达水平降低引起的可能性，本研究检测了榄香烯对U87 细胞总14 -3 -3 表达水平的影响，各组总14 -3 -3 表达无明显差异(P ＞0.05)。提示榄香烯作用于U87 细胞可引起磷酸化ERK 和Raf-1 蛋白表达的下降，并提示随着药物作用剂量的增加，呈现渐进性降低。最终抑制U87 细胞赖以生存的Raf/MEK/ERK 通路，从而抑制其增殖。

［1］ Zhao YS，Zhu TZ，Xu YH，et al. β - elemene inhibits 14 -3 -3/Raf-1 molecular complex inducing apoptosis of glioblastoma cells［J］. Neuroncol，2012，107(2):307 -314.

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［3］ Zhu TZ，Zhao YS，Xu YH，et al. β - Elemene inhibits proliferation of human glioblastoma cells and causes cellcycle G0/G1 arrest via mutually compensatory activation of MKK3 and MKK6［J］.Int J Oncol，2011，38(2):419 -426.

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［5］ Chappell WH，Steelman LS，Long JM，et al. Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR inhibitors:rationale and importance to inhibiting these pathways in human health［J］.Oncotarget，2011，2(3):135 -164.

［6］ Qi MS，Elion EA. MAP kinase pathways［J］. Cell Sci，2005，118(16):3569 -3572.

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［10］ Cho W. Proteomics technologies and challenges［J］. Genomics Proteomics Bioinformatics，2007，5(2):77 -85.