不同方法对人参皂苷Re提取效果的影响

孙雨薇，王珊珊，徐 浩，余 勇，吴明辉，丁之恩（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

不同方法对人参皂苷Re提取效果的影响

孙雨薇，王珊珊，徐 浩，余 勇，吴明辉，丁之恩*
（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

采用六种常规方法提取西洋参叶中皂苷，并结合HPLC-UV检测六种提取方法下所得人参皂苷Re的含量，考察不同提取方法下人参皂苷Re含量的差异，确定最佳西洋参叶中皂苷提取方法。结果表明：乙醚脱脂-甲醇超声提取西洋参叶总皂苷及人参皂苷Re含量最高，在乙腈-水梯度洗脱条件下，人参皂苷Re保留时间在15.2min，色谱峰分离效果好。

西洋参叶，人参皂苷Re，提取，HPLC-UV

西洋参（Panax quinquefolium L.）系五加科人参属多年生草本植物。我国自20世纪80年代大面积成功引种西洋参以来，已发展成为继美国、加拿大后世界第三大西洋参生产国和世界第一大消费国。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，功能以补益为主，可滋阴降火、益气生津[1]。药理研究表明，西洋参生药活性成分为皂苷类成分[2]，为主要次生代谢产物，按其皂苷元的不同分为：达玛烷型四环三萜类皂苷、齐墩果酸型五环三萜皂苷、奥克梯隆型皂苷及其他类型皂苷，目前为止，从西洋参中已发现60多种人参皂苷[3]。

目前，国内外对西洋参根中人参皂苷含量及生理活性的研究很多[4-10]，但对西洋参叶中皂苷含量及提取方法的研究甚少。本文采用六种不同的常规提取方法提取西洋参叶中的皂苷成分，并利用HPLC-UV法测定六种提取方法下单体皂苷Re的含量，系统考察不同提取方法提取西洋参叶皂苷效果的差异，从而确定最佳西洋参叶中皂苷的提取方法，为西洋参叶的深入开发利用提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西洋参叶 来自安徽金寨县竺山参业有限公司生产基地4年生植株新鲜叶片，2013年4月下旬采摘，原料带回实验室，在80℃条件下烘干、粉碎（过40目筛）保存，备用；乙腈 色谱纯；水 实验室制备三级蒸馏水；甲醇 分析纯；人参皂苷Re对照品（批号：HM0523XA1） 购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，于4℃冷藏保存。

Waters液相色谱系统（包括1525 Binary HPLC Pump、Waters 2707 Autosampler、Waters Temperature Control ModuleⅡ、Waters 2489 UV/Visible Detecto）美国。

1.2 实验方法

1.2.1 西洋参叶总皂苷的提取分离

1.2.1.1 甲醇超声提取-大孔树脂柱分离纯化法 取干样品约0.5g，精密称定，加入适量甲醇后超声提取1h，提取液蒸干，加水溶解，上AB-8大孔树脂柱，依次用水和80%甲醇洗脱，收集80%甲醇相蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至25mL容量瓶，即得供试样品（样品1）。

1.2.1.2 乙醚脱脂-甲醇超声提取法 取干样品约0.5g，精密称定，置于索氏提取器中，用乙醚脱脂1h，残渣挥尽乙醚，置具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声提取1h，放冷，过滤，滤液定容到25mL容量瓶，即得供试样品（样品2）。

1.2.1.3 甲醇超声提取法 取干样品约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声提取1h，放冷，过滤，滤液定容到25mL容量瓶，即得供试样品（样品3）。

1.2.1.4 水浸提法 取干样品约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL纯水，50℃水浴提取1h，过滤，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容到25mL容量瓶，即得供试样品（样品4）。

1.2.1.5 甲醇浸提法 取干样品约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，50℃水浴提取1h，过滤，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容到25mL容量瓶，即得供试样品（样品5）。

1.2.1.6 微波辅助提取法 取干样品约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL纯水，在微波炉中微波提取3次（每次加热至沸腾3次），放冷，过滤，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容到25mL容量瓶，即得供试样品（样品6）。

1.2.2 对照品溶液的制备 取人参皂苷Re对照品20mg，精密称定，加入甲醇，溶解，制成2.0mg/mL的溶液，即得人参皂苷Re对照品溶液。

1.2.3 香草醛-硫酸比色法测定总皂苷的含量

1.2.3.1 标准曲线的绘制 精密吸取人参皂苷Re对照品10、30、50、60、80、100、120、140、160μL至10mL容量瓶，水浴蒸干甲醇后分别加入8%香草醛乙醇溶液（配制1周内可以使用[11]）0.5mL，72%硫酸溶液5.0mL，充分振摇混匀后置60℃恒温水浴上加热10min，立即用冰水冷却10min，摇匀。以试剂作空白，于544nm波长处分别测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标、浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.2387×C-0.0719，R2=0.9995。

1.2.3.2 样品中总皂苷含量的检测[12]精密吸取1.2.1中各样品溶液50μL，各3份，分别置于具塞试管中，按1.2.3.1中方法显色测定吸光度，由回归方程计算总皂苷的含量，并计算平均含量。

1.2.4 HPLC法测定人参皂苷Re 色谱条件：色谱柱为C18柱（250mm×4.60mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序见表1；柱温35℃，流速0.5mL/min，检测波长203nm，进样量10μL。在表1梯度洗脱条件下，Re保留时间在15.2min左右，且分离效果好，能够满足人参皂苷Re的检测分析要求。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The program of gradient elution

2 结果与分析

2.1 香草醛-硫酸比色法检测西洋参叶总皂苷含量

由表2可以看出，样品2总皂苷含量最高，即乙醚脱脂-甲醇超声提取法提取西洋参叶总皂苷含量最高。西洋参叶中总皂苷含量在10%左右。六种不同提取方法结果显示，叶中脂类对皂苷的提取有阻碍作用，乙醚脱脂处理能够破坏植物蜡质层、各类树脂、叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素，从而有利于提取溶剂的渗透和皂苷类物质的溶出。未经脱脂处理的西洋参皂苷粗提物在经大孔吸附树脂纯化时容易堵塞树脂孔道从而降低树脂对皂苷的吸附。但对于西洋参而言，脂类含量较低，提取之前经乙醚脱脂处理通常用量过大或者耗时过长，而对初提物进行乙醚脱脂处理则能够改善，使操作简单，有利于皂苷类成分的纯化。

表2 不同提取方法对西洋参叶总皂苷提取得率的影响Table 2 Effect of different extraction methods on total saponin content of Panax quinquefolium L.leaf

2.2 HPLC法线性关系考察

精密吸取1.2.2对照品溶液100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μL至1mL容量瓶，甲醇定容，按1.2.4项色谱条件分析，以人参皂苷Re的浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制Re标准曲线如图1，并进行线性回归，得人参皂苷Re的回归方程：Y=3×106X-51802，R2=0.9991，在0.4～2.0mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

图1 Re皂苷标准曲线Fig.1 Standard curves of Re saponins

2.3 精密度实验

精密吸取对照品溶液10μL，按1.2.4项色谱条件重复进样6次，测得人参皂苷Re峰面积的RSD=0.087%，保留时间RSD=0.044%。结果表明，本实验仪器的精密度良好。

2.4 稳定性实验

图2 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram

表3 精密度实验结果Table 3 Test results of precision

表4 稳定性实验结果Table 4 Results of stability test

精密吸取同一供试品（样品2）溶液20μL，按1.2.4项色谱条件，在0～15h内每隔2.5h进样一次，测得人参皂苷Re峰面积的RSD=0.129%，保留时间的RSD= 0.162%。结果表明，供试品在15h内稳定性良好。

2.5 重现性实验

按照1.2.1项，重新制备皂苷提取样品1～6，先定容25mL，取15mL定容到5mL，即浓缩原样品，按照1.2.4项色谱条件进样，测得人参皂苷Re峰面积及含量如表5所示。

表5 重现性实验结果Table 5 Results of reproducible test

与表7结果比较，可以看出这六种方法的重现性较稳定，乙醚脱脂-甲醇超声提取法的提取效果最好。

2.6 加标回收率实验

取已知含量的2.5中样品各0.6mL，精密移取。每份样品中添加0.6mL对照品，将供试品溶液与对照品溶液以1∶1的体积混合，按1.2.4项色谱条件分析，测得人参皂苷Re的平均回收率为：98.330%，RSD=0.935%。结果显示，Re加标回收效果好。详见表6。

2.7 HPLC法测定样品Re含量结果

取1.2.1六种供试品溶液分别进行Re含量测定（色谱条件同1.2.4），色谱图见图2，结果见表7。结果显示，Re色谱峰保留时间为15.2min左右，样品2中Re含量最高，其次是样品1。即，乙醚脱脂-甲醇超声提取法提取西洋参叶Re皂苷含量最高。

表6 回收率实验结果Table 6 Results of recovery test

3 结论与讨论

本实验用6种不同的提取方法对西洋参叶中人参皂苷Re进行含量测定，结果表明用乙醚脱脂-甲醇超声提取法为最佳制备方法，此法提取率高、重现性好、加标回收率稳定，且操作简单。大孔树脂柱法（AB-8树脂）对单体皂苷Re的提取率也比较高，但操作复杂，需对粗提物进行脱脂处理，以防树脂堵塞。其他4种方法都有较大的损失，且杂质太多，不利于含量测定，不能反应西洋参叶中皂苷的实际含量，故而我们选择乙醚脱脂-甲醇超声提取法提取西洋参叶中皂苷。

实验发现，供试品为从西洋参叶中直接提取所得，背景干扰较大，色谱峰很难分离。本文通过调整流动相浓度和洗脱时间梯度，优选满足本实验分析要求的色谱条件，梯度洗脱，分离效果良好。

由于用药习惯等因素的影响，许多药用植物的其他部位都没有被利用[13]。本实验结果显示西洋参叶中皂苷含量较高，是提取人参皂苷的一个重要资源，采用乙醚脱脂-甲醇超声提取法能够有效提取西洋参叶皂苷，有利于西洋参的综合利用，对充分开发利用和保护药用植物资源有重要意义。

表7 样品测定结果Table 7 Results of sample determination

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Effect of different kinds of conventional extraction methods on the contents of ginsenoside Re from Panax quinquefolium L.leaf

SUN Yu-wei，WANG Shan-shan，XU Hao，YU Yong，WU Ming-hui，DING Zhi-en*
（College of Tea and Food Technology，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China）

In this experiment，six conventional methods were used to extract panax quinquefolium saponin from leaves，and HPLC-UV method was used to detect the content of six kinds of method for extracting monomer ginsenoside Re，to investigate the content of different extraction methods monomer ginsenoside Re，finally，to determine the bestextraction method.The results showed that：in the premise of ether degreasing，we used methanol ultrasonic to extract panax quinquefolium saponin from leaves，then got the highest content of the total saponins and ginsenoside Re.Results under the gradient elution condition between water and acetonitrile，the retention time of Re was 15.2min，and the chromatographic peak was clear and distinguished.

Panax quinquefolium L.leaf；ginsenoside Re；conventional extraction；HPLC-UV

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0301-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.058

2013－09－26 *通讯联系人

孙雨薇（1987-），女，硕士研究生，主要从事营养与食品卫生学方面的研究。

国家自然基金项目（30271100）。