一株生防酵母菌的筛选鉴定及对葡萄采后病害的生防效果

李 强，张红印，杨其亚，王峻峻，李超兰（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

一株生防酵母菌的筛选鉴定及对葡萄采后病害的生防效果

李 强，张红印*，杨其亚，王峻峻，李超兰
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

从桑葚中筛选得到一株具有潜在生防效力的酵母，经分子生物学鉴定及生物化学检验，确定其为酿酒酵母。该酵母对葡萄采后黑曲霉病具有显著的抑制效果，随着酵母菌浓度的增高，葡萄腐烂率逐步降低；当酿酒酵母浓度为1×108cfu/mL时，对葡萄黑曲霉病的抑制效果最好。在20℃和4℃条件下，该酵母在葡萄伤口处能快速繁殖，能显著抑制葡萄自然腐烂率，而对其贮藏品质影响不显著。

筛选，鉴定，酿酒酵母，葡萄，采后病害，生物防治

葡萄营养丰富，具有很高食用价值及医疗保健价值，是我国五大名果之一[1]。据统计，在全世界范围内，每年有27%左右的葡萄因采后处理不当而损失[2]。目前针对葡萄保鲜，国内外广泛应用二氧化硫防腐技术，其易导致葡萄漂白、伤害、异味等问题，极大降低葡萄贮藏品质与商业价值[3-4]。近年来用微生物进行水果采后病害的生物防治是国内外发展起来的一个新的研究领域[5]。Wilson等报道指出可以利用水果表面的伤口分离拮抗酵母[6]。这种方法可以快速地筛选到拮抗酵母，从而缩小了筛选周期和费用，已用于许多采后生物防治方案。

本论文从桑葚果中分离筛选得到一株拮抗酵母-Y-912。通过形态学特征、生理生化特征以及分子生物学鉴定，确定该酵母为Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）。目前，尚未见该酵母在水果采后生防中应用的报道，因而具有很好的应用潜景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄（Vitis vinifera） 品种为夏黑，购买于江苏省句容市，早晨采摘后立即运到实验室进行实验，选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，分组待用；桑葚（Fructus Mori） 采自江苏省镇江市江心洲生态果园。

全自动高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；双层全温摇床 太仓市强乐实验设备厂；TGL-16M型台式高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；血球计数板 丹阳市健陵医疗器械公司；LRH-250型生化培养箱 上海一恒科技有限公司；ABI型基因扩增仪 美国ABI公司；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪 北京六一；科龙BCD-276AK4型冰箱 广东科龙电器股份有限公司。

1.2 培养基

PDA培养基：200g去皮马铃薯加水煮沸20min后过滤，滤液加入20g葡萄糖，20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

NYDA培养基：酵母浸膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g加水至1000mL，121℃灭菌20min。

NYDA液体培养基：酵母浸膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，加水至1000mL，121℃灭菌20min。

McClary醋酸琼脂培养基：葡萄糖1g，氯化钾1.8g，酵母抽提物2.5g，三水醋酸钠8.2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

1.3 实验方法

1.3.1 拮抗酵母的筛选 取桑葚，榨汁，取果汁1mL，放入装有10mL无菌水的离心管中，充分振荡混匀，取混匀液，做梯度稀释（10-4、10-5、10-6、10-7），平板涂布法，涂布在NYDA培养基上，28℃培养20～36h，挑取优势酵母单菌落，在固体NYDA平板划线，纯化培养，接种于NYDA斜面4℃下低温保存。

1.3.2 形态学鉴定

1.3.2.1 液体培养特征 挑取已活化好的菌体1环接种到装有NYDA液体培养基锥形瓶中，在25℃下静置培养1～2d，过程中观察并记录。

1.3.2.2 固体培养特征 将活化好的菌株在NYDA斜面上划线，25℃培养1～7d，过程中观察并记录。

1.3.2.3 有性阶段观察 在NYDA上25～28℃下培养2d，然后再转接至诱导培养基上，接种量应尽量的少。观察是否形成子囊，并记录子囊的形成时间。

1.3.3 生理生化鉴定

1.3.3.1 糖类发酵 12.5%豆芽汁为基础液，吸取一定量的糖液分装于杜氏管，使糖浓度达到2%，然后将活化好的菌株分别接种于发酵管，25～28℃下培养，每天观察结果。

1.3.3.2 碳源同化 采用生长图谱法来测定待测菌种对碳源的同化情况。

1.3.4 分子的生物学鉴定 扩增拮抗酵母ITS序列的引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。以菌株DNA（菌体在温度达到DNA变性温度的时候裂解释放出DNA）作为模板进行以特异性引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。首先于平板培养基上挑一个单菌落于1mL无菌水中打匀制成菌悬液。于200滋L微量离心管中，依次加入超纯水8.5滋L、正反引物各1滋L、PCRsupermix12.5滋L、待测酵母菌悬液2滋L。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃1min，54℃退火2min，72℃延伸2min，36个循环，72℃延伸10min。PCR产物送到上海生工生物工程服务有限公司测定。测序结果通过DNAStar、Chromas软件校对，并在NCBI网站上利用Blast程序进行核酸序列的比对分析。用MEGA 5.1软件构建系统发育树并分析。

1.3.5 拮抗酵母对葡萄采后黑曲霉病害的抑制效果 2%的次氯酸钠溶液浸泡1min，清水洗净，然后晾干。在果实腰部用打孔器打2个直径为3mm、深为3mm的孔，每孔注射10滋L浓度为1×106、1×107、1×108以及1×109cfu/mL拮抗菌细胞悬液，2h后接种病原菌孢子悬液10滋L。晾干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95%的湿度，在20℃下贮藏，4d后统计果实的发病腐烂率。每处理30个果实。整个实验重复2次。

1.3.6 拮抗酵母在葡萄伤口处生长动态 葡萄的表面打一个直径为3mm、深为3mm的孔。用移液枪吸取10滋L 1×108cfu/mL的拮抗酵母菌悬液加入葡萄伤口处，将葡萄置于塑料筐中，用保鲜膜密封塑料筐，以保持塑料筐内湿度（95%左右）。将塑料筐分别置于20℃和4℃的培养室内进行培养，每隔一段时间取样测定果实伤口处的拮抗酵母数。采用张红印测定方法[7]，每个处理重复3次，每次处理6个水果，整个实验重复2次。

1.3.7 拮抗酵母对葡萄自然腐烂的抑制效果及贮藏品质影响 配制1×108cfu/mL的拮抗酵母菌悬液，以无菌水作为对照。将完整无损的葡萄分别置于拮抗酵母悬浮液及无菌水中，浸泡30s时间，自然晾干后，用保鲜袋对葡萄进行逐果包封，置于塑料筐中，进行以下贮藏：a.在温度为20℃相对湿度为95%的恒温恒湿培养箱中贮藏15d；b.在温度为4℃的冰柜中贮藏10d后转入温度为20℃相对湿度为95%的恒温恒湿培养箱中继续贮藏7d。贮藏结束后统计果实发病率，并进行贮藏品质分析。每个处理重复3次，每次随机挑选10个果实，整个实验重复2次。贮藏品质分析方法如下：

1.3.7.1 失重率 采用称重法。失重率（%）=（储藏前质量-储藏后质量）/储藏前质量×100。

1.3.7.2 硬度 采用TA-XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度都为1.0mm/s，测试深度为10mm，探头插入水果时所受的最大阻力（单位为牛顿）就被定义为水果的硬度。每个水果绕赤道处每120°测定1次，测3次取平均值。1.3.7.3 总可溶性固形物 采用Larrigaudière等的方法[8]，采用WYT（0～80%）手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。每个处理重复3次。

1.3.7.4 可滴定酸度（%） 采用滴定法，参照郝建军等的方法[9]。每个处理重复3次。

1.3.7.5 维生素C含量的测定 采用紫外快速测定法。每个处理重复3次。

1.3.7.6 褐变度 采用Lee的方法[10]。每个处理重复3次。

1.3.8 数据统计 全部实验数据用Microsoft Excel 2007进行统计处理，计算标准偏差（±SE）；并使用SPSS 19数据处理进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

2.1.1 细胞形态学特征 Y-912菌株在NYDB液体培养基中，28℃下培养1d后，镜检，细胞呈卵圆形，无性繁殖方式芽殖；固体培养时，菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形，不透明，表面圆润光滑。

2.1.2 子囊孢子的形成 Y-912菌株在生孢培养基上28℃培养3d，形成子囊孢子，内生4个孢子。

2.2 生理生化特征

待测酵母菌对相关糖类利用情况如下：

从表1可以看出，待测酵母Y-912对葡萄糖、蔗糖、海藻糖等能进行发酵，对麦芽糖、乳糖、淀粉等不能进行发酵；对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖等能进行同化，对乳糖及淀粉等不能进行同化。

2.3 分子学鉴定

将Y-912菌株ITS核酸序列与NCBI资料库中已有的核酸序列作比对，其中Saccharomyces cerevisiaestrain AY939814.1曾发表于期刊Soil Science上的标准菌株，故Y-912菌株为Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）。菌株Y-912与从GenBank获得的菌株采用最大简约法（max-imum parsimony method）构建ITS进化树（图1），明确表明该菌株是酿酒酵母菌。

表1 待测酵母菌对相关糖类利用情况Table 1 Take use of some carbohydrates

图1 根据ITS区序列数据用最大简约法参构建的系统进化树Fig.1 The phylogenetic tree using max-imum parsimony method based on ITS sequences

2.4 酿酒酵母葡萄黑曲霉病的控制效果

从图2可以看出，与CK组相比，1×106、1×107、1×108、1×109cfu/mL的酿酒酵母Y-912均能显著的抑制葡萄黑曲霉病（p＜0.05），且随着浓度的增大抑菌效果增强。使用1×108cfu/mL的酵母，葡萄腐烂率降低了84.4%。

图2 不同浓度Y-912对葡萄黑曲霉腐烂率的抑制效果Fig.2 Effect of the different concentrations of Y-912 in inhibiting Aspergillus niger decay of grapes

2.5 酿酒酵母在葡萄伤口处的生长动态

从图3（a）可以看出，20℃贮藏时，酿酒酵母Y-912在葡萄伤口处数目迅速增加，至第2d基本达到最大值；而4℃贮藏时（b）酿酒酵母在葡萄伤口处数目在初始得2d增加迅速到第3d达到最大值，但明显低于20℃，之后数目开始减少。

2.6 酿酒酵母对葡萄自然腐烂及贮藏品质的影响

图3 酿酒酵母Y-912在葡萄伤口处的生长动态Fig.3 Population dynamics of Saccharomyces cerevisiae Y-912 in the wound of grapes

2.6.1 Y-912对葡萄自然腐烂率的抑制效果 从图4可看出，使用Y-912悬液处理果实，无论是贮藏在20℃还是4℃均能显著抑制葡萄的自然腐烂率。在20℃贮藏15d后，经酵母处理的葡萄自然腐烂率为38.3%，而对照组为51.7%；在4℃贮藏10d后转入20℃贮藏7d后，经酵母处理的葡萄自然腐烂率为41.7%，而对照组为61.7%。

图4 Y-912对葡萄自然腐烂的控制效果Fig.4 Effect of Y-912 on natural decay development of grapes

2.6.2 Y-912对葡萄贮藏品质的影响 从表2可以看出，在20℃贮藏15d，经酵母处理的葡萄品质与对照组无明显差异。在4℃贮藏10d后再转入20℃贮藏7d，经酵母处理的葡萄除硬度和可溶性固形物与对照组差异显著外，其他品质并无明显差异。说明使用Y-912处理葡萄对其贮藏品质影响不显著。

3 结论

本研究从桑葚中成功筛选到一株具有潜在生防作用的酵母—Y-912。经形态学鉴定、生理生化鉴定以及分子学鉴定，确定该酵母为酿酒酵母。目前尚未有报道其被用于水果的采后病害抑制，因而具有良好的研究前景。

表2 Y-912对葡萄贮藏品质的影响Table 2 Effect of Y-921 on postharvest natural quality parameters of grapes

黑曲霉是引起葡萄采后病害的重要致病菌，用酿酒酵母处理的葡萄，能有效地减少黑曲霉病的发生，且对黑曲霉菌的抑制作用与菌悬液浓度有关，当酵母菌浓度为1×108cfu/mL，对黑曲霉菌的防治效果最好。从酿酒酵母在葡萄伤口处的生长动态结果可以看出，该酵母能在水果伤口处迅速生长繁殖。这两个结果说明了营养与空间的竞争在酿酒酵母抑制致病霉菌过程中所起的作用，酿酒酵母在水果的表面或伤口处迅速生长，占领表面或伤口处的营养空间，消耗了其中大量的营养物质，从而起到抑制致病霉菌生长的作用。

酿酒酵母对葡萄整果贮藏时自然腐烂有显著的抑制作用，显示了酿酒酵母应用于水果采后生物防治的潜力。经酿酒酵母处理的葡萄，在贮藏期间的品质指标与对照相比，没有造成不良影响。酿酒酵母能有效地抑制葡萄腐烂，使其产业化应用于葡萄采后生防成为可能。酿酒酵母防治葡萄采后病害的机制有待于进一步研究。

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Screening and identification of an antagonistic yeast and its control efficacy to postharvest decay of grapes

LI Qiang，ZHANG Hong-yin*，YANG Qi-ya，WANG Jun-jun，LI Chao-lan
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

A strain of potential antagonistic yeast was isolated from mulberry fruits，which showed the biocontrol efficacy against postharvest decay of grapes.By molecular biological identification and biochemical examination，the antagonistic strain was identified as Saccharomyces cerevisiae.The antagonist showed significant biological control efficacy against postharvest decay of grapes caused by Aspergillus niger.When the concentration of the antagonist was higher，the disease incidence was lower.The concentration of S.cerevisiae was 1×108cfu/ mL，the inhibition effect of grapes diseased by Aspergillus niger was best.Rapid growth of the antagonists in wounds was observed at 20℃ and 4℃.S.cerevisiae significantly reduced the natural development of decay and did not have significant effect on postharvest natural quality.

screening；identification；Saccharomyces cerevisiae；grapes；postharvest decay；biocontrol

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0182-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.032

2013－10－24 *通讯联系人

李强（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食品微生物学。

教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20123227110015）；镇江市农业科技支撑项目（NY2013004）。