无花果多糖的纯化及其抗氧化活性研究

李文婕，杨小明，*，张赫男，李世超，方洋洋（.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江03；.江苏大学化学化工学院，江苏镇江03）

无花果多糖的纯化及其抗氧化活性研究

李文婕1，杨小明1，*，张赫男1，李世超1，方洋洋2
（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江苏大学化学化工学院，江苏镇江212013）

目的：探讨无花果多糖（Ficus carica polysaccharides，FCPS）的分离纯化及其抗氧化活性。方法：采用水提醇沉法提取，Sevage法除蛋白、膜过滤后冻干得到无花果多糖，再经DEAE-52纤维素柱纯化；以UV等方法考察多糖的理化性质，高效凝胶色谱测定多糖的纯度和相对分子质量分布；并研究其抗氧化活性。结果：经水提醇沉、膜过滤后得到的FCPS为混合酸性多糖，不含蛋白质、核酸，分子量范围在5.92×105～2.0×106u之间；DEAE-52柱分级得到FCPS的三个馏分：FCPS1、FCPS2和FCPS3，高效凝胶色谱分析显示FCPS2为一对称峰，分子量约为2.61×106u。抗氧化活性实验显示清除超氧负离子能力IC50FCPS2为430滋g/mL，FCPS为620滋g/mL；清除羟基自由基IC50FCPS2为1000滋g/mL，FCPS为4780滋g/mL。在浓度为1000滋g/mL时，FCPS2和FCPS的还原能力分别为0.055和0.133。结论：FCPS经纯化后得到的组分FCPS2较FCPS表现出更好的清除超氧负离子和清除羟基自由基的能力，但还原能力有所降低。

无花果多糖，分离纯化，抗氧化

抗氧化作用一直以来是医学研究的重要环节，许多慢性病如心脑血管疾病、糖尿病、高血压以及肿瘤等疾病，主要是由于人体内过量的自由基引发氧化应激，从而造成细胞损伤所致。天然抗氧化活性成分能够清除自由基，避免细胞由于自由基的作用而被老化、损伤或产生DNA突变，从而达到保护机体的作用[1]。因此研究食物中的抗氧化活性成分，对于有效地指导人们合理利用膳食、提高人体抗病能力、促进人类健康和延长人类寿命具有重要意义。

无花果是一种可食率高达92%以上的浆果，含有丰富的糖类、蛋白、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素等营养物质，其中以多糖的功效尤为引人关注。据目前已有的研究表明，无花果多糖具有抗肿瘤[2]、提高免疫力[3]、降血糖[4]、降血脂[4]等功效。杨小明等[5]发现无花果粗多糖显示出良好的抗氧化活性。为了深入了解无花果多糖中的抗氧化活性组分，本研究拟对无花果多糖进行分级纯化，并检测其抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无花果 由江苏省丰县中研无花果开发有限公司提供，品种为日本紫果，压榨取汁后得到残渣，经45℃烘干，粉碎过20目筛备用；DEAE-52纤维素交换树脂（柱层析用） 上海国药集团进口分装；NBT、NADH、浓硫酸、无水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、丙酮、NaCl、NaOH、HCl等试剂 上海化学试剂有限公司；提取用水 为二次蒸馏水；分析用水 为娃哈哈纯净水。

高效液相系统 ProStar210泵、ProStar 355 RI检测器，美国VARIAN公司；BS-124S电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；RE-52C型旋转蒸发仪、SHZ-D型循环水式多用真空泵、HH-S型水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；Pellicon小型超滤系统 美国Millipore公司；ALPHA2-4型冷冻干燥机 德国CHRIST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无花果多糖的提取 根据文献[6]的实验方法略加修改：50g干燥无花果渣粉以石油醚脱脂三次后加入500mL蒸馏水，于100℃提取180min，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液。将滤液浓缩至原体积的1/4后，Sevage法除蛋白，经6次脱蛋白后，在搅拌条件下，缓慢加入四倍体积的无水乙醇沉淀，于4℃静置12h，离心分离，收集沉淀，即得无花果粗多糖。

无花果粗多糖加水溶解，用截留分子量为10ku的平面纤维素超滤膜超滤（ΔP=0.1MPa，T=25℃），收集分子量大于10ku部分，在60℃以下浓缩至原体积的1/4，搅拌下慢慢加入无水乙醇至75%浓度，4℃静置12h，离心（3000r/min，20min）分离，沉淀以无水乙醇、丙酮洗涤，冷冻干燥，得无花果多糖（FCPS）。

1.2.2 无花果多糖理化性质分析

1.2.2.1 无花果多糖性状及理化性质 参照文献[6]对无花果多糖进行外观及溶解性、碘-碘化钾反应、Molish试剂反应、茚三酮反应、紫外光谱检测等验证分析。

总糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准单糖；蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.2.2 无花果多糖等当点测定 准确称取105℃干燥恒重的无花果多糖样品0.15g于100mL的三角烧瓶中，加入20mL蒸馏水及0.057mol/L标准HCl溶液20mL，在室温下溶解。磁力搅拌下用0.054mol/mL标准NaOH滴定。每滴入1mL NaOH溶液测定pH一次。以加入的NaOH溶液体积为横坐标，测得的pH为纵坐标绘图，找出曲线突跃点对应的pH即为无花果多糖的等当点。

1.2.3 无花果多糖的分级分离 取150mg无花果多糖溶于10mL热蒸馏水中，充分溶解后离心，取上清液加入层析柱（Φ1.0×50cm，DEAE-52高45cm）上，洗脱梯度为蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液，流速0.3mL/min，每30min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖洗脱情况，以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，合并同一洗脱峰的洗脱液。透析（10ku cut-off）脱盐，真空干燥（45℃、≥0.095MPa）。

1.2.4 无花果多糖的纯度鉴定及分子量分布测定 凝胶色谱条件：糖柱为TSK-GEL G4000PW（TOSOH CORPORATION）。流动相：娃哈哈纯净水，流速0.5mL/min，柱温（35±0.1）℃。

用标准葡聚糖Dextran T系列（分子量104、4×104、7×104、5×105和2×106u标准葡聚糖）制作标准曲线，然后根据多糖样品在相同的色谱条件下的洗脱体积或保留时间，从标准曲线上求出该样品的分子量。

1.2.5 无花果多糖及其馏分抗氧化活性研究

1.2.5.1 清除超氧负离子的能力 采用PMS-NADHNBT体系[7]。反应体系：1.5mL不同浓度样品溶液（溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），0.5mL氯化硝基四氮唑NBT（300μmol/L溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），0.5mL还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH（468μmol/L溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），加入0.5mL吩嗪硫酸二甲酯PMS（60μmol/L）启动反应，25℃水浴5min，空白对照为样品代替为缓冲溶液（Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L）反应完成于560nm测定，结果计算按以下公式进行。

式中：SE-清除超氧负离子的能力（Scavenging effect）；A1-样品测试值；A0-空白值（缓冲液代替样品）。

1.2.5.2 清除羟基自由基的能力[8-9]取1mL 0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中依次加入2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.40）和1mL蒸馏水，充分混匀后，加入1mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液（FeSO4），混匀后，加入1mL 0.01%双氧水（H2O2），于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值，所测得的数据为损伤管的吸光值A损。未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中1mL 0.01%的双氧水（H2O2），操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光值A未。样品管以1mL样品代替损伤管中的1mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管的吸光值A样。清除率I的计算公式：

1.2.5.3 还原能力[10-11]1mL样品测试液，加入2.5mL PBS（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL铁氰化钾（1%），混合均匀，50℃反应20min。接着加入2.5mL三氯乙酸（10%），进行离心（2000r/min，10min），吸取上清液2.5mL与0.5mL FeCl3（0.1%）混合，在700nm处测定吸光度。溶液的吸光度越高，表示还原能力越强。

2 结果与讨论

2.1 无花果多糖的理化性质

2.1.1 无花果多糖表观性状 无花果粉末经水提醇沉、脱蛋白、脱除小分子杂质、冷冻干燥，得到无花果多糖，其外观为浅灰色疏松状粉末，无味，易溶于水，水溶液pH4.2，难溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。碘-碘化钾反应呈阴性，说明所得产品中不含淀粉；茚三酮反应呈阴性，说明所得产品中不含有蛋白质；其紫外光谱验证，无花果多糖在260、280nm处没有蛋白质、核酸的特征吸收；192nm处有明显的吸收峰，表现为糖的特征吸收（见图1）。Molish反应呈阳性，说明所得产品中含有糖类物质。根据公式计算得无花果多糖的得率为4.1%，按苯酚-硫酸法测得总糖含量为91%。

图1 无花果多糖的紫外光谱Fig.1 UV Spectrum of FCPS

2.1.2 等当点测定[12]等当点（equivalent point）是当滴加的标准溶液和被测物质恰好反应时，这一时刻称为等当点。测定多糖的等当点可以更好地了解多糖的酸碱性。

图2 FCPS等当点滴定曲线Fig.2 The titration curve of determine FCPS equivalent point

在酸碱中和滴定中，到达等当点时溶液不一定都是中性的，有时呈酸性、有时呈碱性，这要看中和后生成盐的性质。强酸和强碱的中和滴定，在等当点时溶液呈中性；强碱滴定弱酸，因生成的盐又要水解，在等当点时溶液呈碱性；同理，强酸滴定弱碱，在等当点时溶液呈酸性。FCPS等当点测定结果见图2，可知FCPS等当点为6.92，因此FCPS是弱酸性的多糖。

2.1.3 分子量测定 分别采用分子量为104、4×104、7×104、5×105和2×106u标准葡聚糖按分析条件进样，记录各分子量葡聚糖的保留时间RT，以分子量对数为纵坐标，RT为横坐标作图（见图3），采用最小二乘法回归得到葡聚糖分子量M与RT的对应回归方程：LgM=9.6188－0.3246RT，r=0.9947。

将FCPS样品在同样条件下进样，其分析图谱呈现出现一系列高低不等的峰值，这表明FCPS是混合多糖。将其最初及最终出峰时间，带入标准曲线计算，得知无花果多糖的分子量分布范围在5.92×105～2.0×106u之间。

图3 排阻色谱法分子量分布测定标准曲线（Mean±SD，n=3）Fig.3 The calibration curve of the dextran series in HPGPC（Mean±SD，n=3）

2.2 无花果多糖的分级纯化

由于FCPS为混合多糖，为了获得FCPS的均一性组分，采用DEAE-52离子交换树脂对FCPS进行分离，采用0、0.1、0.2、0.3和0.4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液以苯酚-硫酸法追踪多糖，分析结果见图4。从图4可知，当NaCl浓度为0、0.1和0.2mol/L时，分别有一多糖馏分出现，各自标记为FCPS1、FCPS2和FCPS3；NaCl洗脱液浓度达到0.3和0.4mol/L时，未见由多糖洗脱峰出现。

图4 FCPS经DEAE-52柱层析色谱图（Mean±SD，n=3）Fig.4 Elution curve of FCPS on DEAE-52（Mean±SD，n=3）

2.3 FCPS2高效液相凝胶色谱分析和分子量测定

采用高效液相凝胶色谱（HPGPC）对FCPS的三个馏分进行分析，结果可知在纯化得到的三个馏分中，仅FCPS2在高效液相凝胶色谱分析图中出现单一且基本对称的单峰，如图5所示，若要进一步确定FCPS2为均一多糖组分，可采用高压电泳、超离心等方法来辅助验证，这一实验待以后进一步完成。FCPS2的保留时间约为9.866min，带入分子量标准曲线，计算得知FCPS2分子量为2.61×106u。

2.4 FCPS2的体外抗氧化研究

2.4.1 清除超氧阴离子自由基的能力的测试 超氧阴离子自由基是常见的自由基之一，具有较强的氧化能力，在检验抗氧化物质的活性时经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标。本实验的原理是PMS与NADH作用产生超氧阴离子，NBT再利用其还原生成在560nm处有最大吸收的物质，考察560nm吸光度的变化来得知超氧阴离子的被清除率，吸光值越低，表示清除率越高。

FCPS2对超氧阴离子的清除活性如图6所示。在终浓度为500滋g/mL时对超氧阴离子的清除效率约为50.3%，其IC50为430滋g/mL，根据本实验组的实验结果，FCPS清除超氧阴离子的IC50为620滋g/mL。结果表明纯化后得到的多糖组分FCPS2清除超氧阴离子能力比FCPS强。

图5 FCPS2的HPGPC色谱图Fig.5 HPGPC chromatograms of FCPS2

图6 FCPS2、FCPS清除超氧阴离子自由基的能力（Mean±SD，n=3）Fig.6 Scavenging activity of FCPS2 and FCPS on superoxide anion radicals（Mean±SD，n=3）

2.4.2 清除羟基自由基能力的测试 羟基自由基（·OH）是一种十分活泼的活性氧，氧化能力很强。因邻二氮菲-Fe2+溶液（橙红色）被反应生成的·OH氧化成邻二氮菲-Fe3+，在536nm波长处的最大吸收峰消失，故可以根据用邻二氮菲-Fe2+的褪色程度来衡量·OH的清除率。

将FCPS2配成不同浓度，根据1.2.5.2的方法测定其对羟基自由基的清除率，结果如图7所示。可知，FCPS2在体外有一定的清除羟基自由基能力，并随着其浓度的增加清除能力逐渐增强，其IC50约为1000滋g/mL，而根据本实验组实验结果，无花果多糖清除羟基自由基的IC50为4780滋g/mL。表明纯化后得到的多糖组分FCPS2清除羟基自由基能力比FCPS强，这与清除超氧负离子能力测试结果一致。

图7 FCPS2、FCPS清除羟基自由基的能力（Mean±SD，n=3）Fig.7 Activity scavenging hydroxyl radical of FCPS2 and FCPS（Mean±SD，n=3）

2.4.3 还原能力测试 多糖的还原能力与抗氧化活性有明显关系。抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子从而清除自由基。还原能力越强，抗氧化活性越强。在铁氰化钾体系中，Fe3+在抗氧化剂的促进下被还原为Fe2+，形成的Fe2+在700nm处检出。测定的吸光度值越大，还原能力越强。

FCPS2的还原能力测定结果见图8。由图8可见，FCPS2显示出一定的还原能力，并随着浓度的增加，还原能力逐渐增强。在浓度为1000滋g/mL时，FCPS2和FCPS的还原能力分别为0.055和0.133，FCPS2还原能力远低于FCPS。多糖的还原力与其单糖的还原末端暴露的多少有关，我们推测纯化后的单糖组分还原末端暴露估计很少，直接影响到了其还原能力。

FCPS2具有还原铁离子的能力，还原能力随浓度的增加而增加，而且它还具有抑制自由基转移电子的能力，能够使自由基转变成更稳定的产物从而终止自由基一系列的反应。

通过清除超氧阴离子的能力的测试、清除羟基自由基能力的测试和还原能力测试三个方面的实验结果表明，纯化后的FCPS2的抗氧化活性明显强于FCPS。这是因为，多糖的活性与分子量、溶解度、粘度、初级结构和高级结构有关，多糖分子量越大，分子体积越大，不利于跨膜进入生物体内发挥生物学活性，小分子量的多糖更容易结合活性位点，而分子量过低，又无法形成活性的聚合结构。分子量适当大小的多糖，其活性较高[13]。

图8 FCPS2、FCPS的还原能力（Mean±SD，n=3）Fig.8 Reducing power of FCPS2 and FCPS（Mean±SD，n=3）

3 结论

FCPS经柱层析获得三个组分：FCPS1、FCPS2、FCPS3，其中初步验证出FCPS2为均一性组分，分子量约为2.61×106u。实验研究了FCPS2的抗氧化活性，实验显示清除超氧阴离子自由基能力IC50FCPS2为430滋g/mL，而FCPS为620滋g/mL；清除羟基自由基IC50FCPS2为1000滋g/mL，FCPS为4780滋g/mL。在浓度为1000滋g/mL时，FCPS2和FCPS的还原能力分别为0.055和0.133。因此，FCPS2表现出了比FCPS更好的清除超氧阴离子自由基和清除羟基自由基的能力，但FCPS2的还原能力较FCPS低。

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Study on purification and antioxidation of polysaccharides from Ficus carica

LI Wen-jie1，YANG Xiao-ming1，*，ZHANG He-nan1，LI Shi-chao1，FANG Yang-yang2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Objective：To purify the polysaccharides from Ficus carica L.fruit and investigate its antioxidant activity. Methods：Ficus carica polysaccharides（FCPS）was obtained by hot water extracting and ethanol precipitation，removing the protein by Sevage method.Then FCPS was purified by using cellulose DEAE-52.Physicochemical characteristic of polysaccharides was researched by UV and some other methods.HPGPC was used to study the purity and distribution range of relative molecular mass of polysaccharides.And the antioxidant activity of the polysaccharides was tested.Results：FCPS was a kind of mixed acidic polysaccharides which had no protein and nucleinic acid.The relative molecular mass was between 5.92×105and 2.0×106u.The three purified components FCPS1，FCPS2 and FCPS3 were obtained by DEAE-52 cellulose column Chromatography. After HPGPC analyses，FCPS2 showed a symmetrical peak and its molecular mass was 2.61×106u.As about antioxidation，scavenging superoxide anion radical（FCPS2：IC50=430滋g/mL，FCPS：IC50＝620滋g/mL）and scavenging hydroxyl radical（FCPS2：IC50=1000滋g/mL，FCPS：IC50＝4780滋g/mL）were also notedly improved，whereas，the reducing power was 0.055 and 0.133 respectively when their concentrations were 1000滋g/mL.Conclusions：The homogeneous polysaccharides FCPS2 which had been purified showed a better ability to remove superoxide anion and hydroxyl radicals，while its reducing power decreased.

Ficus carica polysaccharides；separation and purification；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0161-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.027

2013－11－06 *通讯联系人

李文婕（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物提取与纯化。