软肝化坚颗粒对肝纤维化C57小鼠体内羟脯氨酸的影响※

杨莉 刘莲 冯爱东 赵金超 王玉泽 戴二黑

（河北省石家庄市第五医院检验科，河北石家庄 050021）

肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化发生的前奏和必经中间环节。肝纤维化是各种慢性肝病进展过程中由于肝内纤维生成与降解失衡，导致过多的胶原在肝内沉积所致［1］。软肝化坚颗粒具有益气活血、软坚化结之功效，是河北省石家庄市第五医院自行研制的用于抗肝纤维化及早期肝硬化的治疗药物，经多年临床观察，疗效显著［2］。本研究通过四氯化碳（CCl4）诱导的C57小鼠肝纤维化模型，观察软肝化坚颗粒对C57小鼠肝纤维化模型血清及肝组织中羟脯氨酸（Hyp）的影响，进一步探讨软肝化坚颗粒对肝纤维化形成过程中胶原分泌的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物C57小鼠40只，雄性，无特定病原体级（SPF），体质量（20±3）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心购进，动物合格证号:0029674。

1.2 实验药物软肝化坚颗粒（批号:090318，冀药制字Z20051044，由河北省石家庄市第五医院制剂室提供）。CCl4由天津市标准件科技有限公司生产。秋水仙碱（阳性对照药）由通化百信药业有限公司生产。0.9%氯化钠注射液由石家庄四药有限公司生产。橄榄油由上海晶纯试剂有限公司生产。检测血清Hyp、转化生长因子β1（TGF-β1）和Ⅰ型胶原的酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒由R＆D公司生产。肝组织Hyp检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器芬兰Thermo公司生产MK3型全自动酶标仪，尤尼柯（上海）仪器有限公司生产的UV-2000型分光光度计。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备及分组实验C57小鼠适应性喂养1周后，随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组。实验开始后每周一、四给予正常对照组C57小鼠腹腔注射橄榄油（橄榄油用量0.1 mL/10 g体质量，每日1次）;模型对照组、模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组腹腔注射10%CCl4造模（10%CCl4用量按0.1 mL/10 g体质量，每日1次）。每次腹腔注射前均测量小鼠体质量，根据体质量注射相应剂量的10%CCl4，并详细记录。2周后，于继续造模的同时，正常对照组、模型对照组每日予0.9%氯化钠注射液灌胃［0.9%氯化钠注射液用量为（0.2 mL/ （次·只），每日1次］，模型软肝化坚颗粒组用软肝化坚颗粒以临床使用剂量进行灌胃［药物用量为0.1 g/ （只·d），每日1次］，模型秋水仙碱组用秋水仙碱灌胃［药物用量为0.003 mg/（只·d），每日1次］。连续用药治疗6周。

1.4.2 标本的收集与处理各组实验小鼠分别在用药的第6周最后1次腹腔注射后4 h，登记编号，记录状态，称质量后给予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，分离血清备用。分离剥取小鼠肝组织，于液氮中保存备用。实验过程中模型对照组死亡3只，模型软肝化坚颗粒组死亡1只，模型秋水仙碱组死亡1只。

1.4.3 血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型胶原检测采用ELISA法测定小鼠血清中Hyp、TGF-β1和Ⅰ型胶原的含量，严格按说明书操作。

1.4.4 肝组织Hyp检测采用样本碱水解法测定小鼠肝组织中Hyp的含量，严格按说明书操作。

1.5 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，同一指标的组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清Hyp、TGF-β1及Ⅰ型胶原含量比较见表1。

表1 各组小鼠血清Hyp、Ⅰ型胶原及TGF-β1含量比较±s

表1 各组小鼠血清Hyp、Ⅰ型胶原及TGF-β1含量比较±s

与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型对照组比较，△P＜0.05

组别nHyp（μg/mL）Ⅰ型胶原（ng/mL）TGF-β1（pg/mL）正常对照组102.83±0.5867.82±26.966 395.46±4 650.11模型对照组74.99±1.64*272.57±82.73*2 3859.90±3 176.49*模型软肝化坚颗粒组93.44±0.64△93.78±39.59△5 961.87±6 206.02△模型秋水仙碱组93.24±0.69△74.17±51.50△6 960.98±3 559.64△

由表1可见，与正常对照组比较，模型对照组血清中Hyp、TGF-β1和Ⅰ型胶原的含量升高（P＜0.05），模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组小鼠血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型胶原的含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）;与模型对照组比较，模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组小鼠血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型胶原的含量均降低（P＜0.05）。

2.2 各组小鼠肝组织中Hyp含量比较见表2。

表2 各组小鼠肝组织Hyp含量比较±s

表2 各组小鼠肝组织Hyp含量比较±s

与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型对照组比较，△P＜0.05;与模型软肝化坚颗粒组比较，#P＜0.05

组别n肝组织Hyp水平（μg/g）正常对照组10135.99±136.95模型对照组7359.50±148.73*模型软肝化坚颗粒组9109.26±34.78△模型秋水仙碱组9231.93±78.54△#

由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组肝组织中Hyp的含量升高（P＜0.05），模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组小鼠肝组织Hyp的含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）;与模型对照组比较，模型软肝化坚颗粒组和模型秋水仙碱组小鼠肝组织Hyp的含量均降低（P＜0.05）;与模型秋水仙碱组比较，模型软肝化坚颗粒组小鼠肝组织Hyp的含量降低（P＜0.05）。

3 讨论

肝纤维化属中医学瘕积等范畴，是慢性肝病向肝硬化发展的重要环节，目前多数学者认为肝纤维化的致病机制为“气滞血瘀”，倡导以活血化瘀为主治疗本病［3］。软肝化坚颗粒方中丹参活血化瘀;黄芪益气健脾，扶助正气;水蛭、三棱、莪术活血通络，软坚消癥;当归、白芍药养血柔肝，缓和药性。诸药合用，共奏活血化瘀、益气健脾之功。本研究通过CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型研究软肝化坚颗粒在抗肝纤维化治疗中对胶原产生及降解的机制进行探讨。本研究结果显示，模型软肝化坚颗粒组小鼠血清中Ⅰ型胶原的含量与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与模型对照组比较则含量明显降低（P＜0.05）。肝纤维化主要由过多细胞外基质（ECM）在肝内沉积所致，而肝脏ECM以胶原为主要成分，主要是Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原，尤其是Ⅰ型胶原是肝纤维间隔的重要来源。本研究结果软肝化坚颗粒组小鼠血清中Ⅰ型胶原的含量与模型对照组相比降低（P＜0.05），显示肝纤维化中胶原产生及降解是软肝化坚颗粒抗肝纤维化的一个作用点，抑制胶原的产生或是促进胶原的降解。

细胞外基质成分主要有4种，它们是胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖及糖粘连蛋白。由于Hyp占胶原蛋白含量的12.2%，弹性蛋白含有少量Hyp（约l%）外，蛋白多糖及糖粘连蛋白均不含Hyp，因此测定Hyp含量可以反映胶原蛋白及ECM的含量［4］。胶原降解后，Hyp不再重复利用，尤其活动性肝纤维化时，胶原合成、降解的速度均增加，导致血清Hyp升高，故血清Hyp水平可间接反映体内胶原代谢情况［4］。本实验结果显示，模型软肝化坚颗粒组小鼠血清中Hyp的含量与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），与模型对照组相比，则含量降低（P＜0.05）。说明模型软肝化坚颗粒组胶原的降解量明显减少。而模型软肝化坚颗粒组小鼠肝组织Hyp的含量与模型对照组相比，其含量降低（P＜0.05）。这说明模型软肝化坚颗粒组小鼠肝组织胶原产生亦明显降低，软肝化坚颗粒通过抑制胶原产生和降解共同发挥抗肝纤维化作用。

TGF-β1是促进肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活和ECM合成的主要细胞因子之一，可通过TGFβ/Smad信号通路激活HSC，抑制TGF-β1及其信导转导将抑制HSC的激活，可抑制胶原的产生。本研究结果显示，模型软肝化坚颗粒组小鼠血清中TGF-β1的含量与模型对照组相比降低（P＜0.05），而在我们以前的研究中通过免疫组化的方法发现软肝化坚颗粒可抑制C57肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1的表达减少［6］，这说明软肝化坚颗粒可通过抑制TGF-β1产生，抑制HSC的活化，从而抑制胶原的形成是软肝化坚颗粒抗肝纤维的机制之一。

另外，研究显示模型软肝化坚颗粒组肝组织中Hyp的含量明显低于秋水仙碱组，这说明软肝化坚颗粒的抗纤维化作用比秋水仙碱的作用更好，而且无副作用，值得更广泛的推广。总之，本研究发现软肝化坚颗粒可以有效降低小鼠肝组织和血清中Hyp的含量，这可能是软肝化坚颗粒防治肝纤维化的机制之一。

［1］张丽华，吕莉莉，张亚囡，等.柴胡总皂苷肝毒性肝纤维化损伤机制研究［J］.中国药物警戒，2012，9（11）:652-655.

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（本文编辑:董军杰）