膜联蛋白A7在胃癌组织中的表达及意义

张 扬，许 倩，陈 龙，李 欣

(承德医学院基础医学研究所,河北承德 067000)

膜联蛋白A7在胃癌组织中的表达及意义

张 扬，许 倩，陈 龙，李 欣△

(承德医学院基础医学研究所,河北承德 067000)

目的:探讨膜联蛋白A7在胃癌组织中的表达变化和意义。方法:分别采用SP免疫组织化学染色法和Western Blotting法检测膜联蛋白A7在55例胃癌组织和25例癌旁正常胃组织中的表达情况。结果:胃癌组织膜联蛋白A7的表达水平明显高于癌旁正常胃组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:膜联蛋白A7高表达可能参与了胃癌的发生发展。

膜联蛋白A7;胃癌;肿瘤

2003-2007年中国胃癌发病与死亡情况分析报道指出，我国胃癌发病率为33.14/10万，在新发生的各类癌症中居第2位，胃癌死亡率为24.34/10万，居癌症死亡的第3位[1]。膜联蛋白A7是钙依赖性磷脂结合蛋白，属于膜联蛋白A家族的成员，具有参与细胞骨架活动、膜受体功能的调节、转导有丝分裂信息以及促进细胞分泌等重要功能[2]。研究显示，前列腺癌、子宫颈鳞癌等多种肿瘤组织膜联蛋白A7的表达异常[3-4]。本研究旨在观察胃癌组织膜联蛋白A7表达的变化，初步探讨膜联蛋白A7与胃癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2011年6月至2012年12月，承德医学院附属医院胃癌手术切除标本55例、癌旁正常胃组织(与癌组织距离＞5cm)25例，所有患者临床资料完整，术前均未进行放疗和化疗。55例胃癌患者，男31例、女24例;年龄28-85岁(中位年龄57岁)，＜60岁23例、＞60岁32例;病理组织学分型:管状腺癌38例、粘液腺癌和印戒细胞癌17例;肿瘤分化程度:高、中分化20例，低分化35例;浸润深度:肿瘤未侵及浆膜30例，突破浆膜和侵及邻近结构25例。所取组织一部分10%中性甲醛固定、常规石蜡包埋、5μm连续切片，一部分入液氮保存。

1.2 主要试剂 膜联蛋白A7小鼠抗单克隆抗体，

Invitrogen公司;免疫组织化学试剂盒，北京四正柏生物科技有限公司;β-actin小鼠抗单克隆抗体，Santa Cruz公司。

1.3 膜联蛋白A7蛋白表达的检测

1.3.1 免疫组织化学染色:采用SP免疫组织化学染色法，一抗工作浓度1:150，以PBS替代一抗作为阴性对照。在显微镜(10×40倍)下观察拍照，每张切片上随机选5个视野，每个标本计数3张切片，采用MiVnt图像分析系统分析阳性产物面积与视野面积的比值，取平均值作为膜联蛋白A7的相对表达水平。

1.3.2 Western Blotting法:取100mg左右液氮保存组织，放入匀浆器中，加1ml细胞裂解液冰上匀浆，收集匀浆悬液，4℃，12000r/min离心15min，取上清，BCA法测蛋白浓度，加5×loading Buffer，95℃变性10min，50μg蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭3h，膜联蛋白A7抗体(1:1000)4℃过夜，TBST洗膜3×10min/次，羊抗鼠二抗(1:3000)摇床上孵育1h，TBST洗膜3×5min/次，ECL发光，显影。FUJI Mini-4000扫描Western Blotting图像，应用Quantity One-4.6.2软件进行定量分析，以目的条带光密度与β-actin条带光密度的比值，作为膜联蛋白A7表达的相对水平。

1.4 统计分析 采用SPSS 16.0统计学软件处理数据，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

膜联蛋白A7的表达:免疫组化染色结果显示，膜联蛋白A7免疫阳性产物位于胃腺上皮细胞胞浆，呈淡黄色或棕黄色。定量分析结果显示，胃癌组织膜联蛋白A7的表达水平明显高于癌旁正常胃组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见附表。

附表 不同胃组织膜联蛋白A7的表达(±s)

附表 不同胃组织膜联蛋白A7的表达(±s)

免疫组化染色 Western Blotting胃癌 0.183±0.025 1.483±0.258癌旁正常组织 0.072±0.033 0.623±0.326 P ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

膜联蛋白A7是Creutz等[5]首次从牛肾上腺髓质分离、纯化的一种能聚集嗜铬细胞颗粒的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，包括两个基本的功能结构域:一个高度可变的氨基末端结构域和一个高度保守的核心结构域。保守的核心结构域有Ca2+和磷脂的结合位点，有利于依赖钙离子促进膜的融合;氨基末端结构域则高度可变，与每一种膜联蛋白各自的特性有关[6]。

近年来，膜联蛋白A7与肿瘤发生发展关系的研究逐渐增多。Srivastava等[7]研究137例敲除膜联蛋白A7基因的小鼠发现，23%的突变体小鼠发生自发性肿瘤，表明膜联蛋白A7基因表达缺失参与了肿瘤的发展过程。此后，膜联蛋白A7与肿瘤相关的类似研究成果相继呈现。Srivastava等[3]发现，前列腺癌中膜联蛋白A7的表达显著降低;Hung等[8]发现，胶质母细胞瘤膜联蛋白A7的表达也显著下调。但也有学者的研究发现与上述结果不同，Srivastava研究膜联蛋白A7在乳腺癌中的表达时发现，乳腺癌膜联蛋白A7的表达明显上调;陈雪等[4]关于宫颈鳞癌的研究发现，从蛋白水平和mRNA水平膜联蛋白A7的表达都是升高的。李欣等[9]利用RNA干扰技术降低膜联蛋白A7在宫颈癌细胞系Hela细胞中的表达，发现Hela细胞的增殖速度明显减慢、凋亡增多，表明膜联蛋白A7可能具有促进Hela细胞增长的作用，提示膜联蛋白A7基因可能是一个促进肿瘤细胞生长的基因。

本研究分别采用免疫组织化学染色法、Western Blotting法研究发现，胃癌组织膜联蛋白A7的阳性表达率明显高于正常胃组织。结合其他学者的研究成果，推测膜联蛋白A7在胃癌的发生发展过程中可能具有促进作用，并提示膜联蛋白A7可能是一个新的参与胃癌发生发展的分子标志物，因此，本研究可为胃癌的临床诊断提供一个新的参考指标。但膜联蛋白A7在胃癌发生过程中具体的作用机制如何，有待进一步研究。

[1]邹小农，孙喜斌，陈万青，等.2003-2007年中国胃癌发病与死亡情况分析[J].肿瘤，2013，32(2):109-114.

[2]Gerke V, Moss SE. Annexins:from structure to function[J] Physiol Rev, 2002, 82(2): 331-371.

[3]Srivastava M, Torosyan Y, Raffeld M.ANXA7 expression represents hormone-relevant tumor suppression in different cancers[J]. Int J Cancer, 2007, 121(12): 2628-2636.

[4]陈雪，高福禄，李欣，等.膜联蛋白A7在人宫颈鳞癌和正常组织中的表达[J].解剖学报，2010，41(4):603-605.

[5]Creutz CE, PazolesCJ, Pollard HB. Identi fi cation and puri fi cation of an adrenal medullary protein (synexin) that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaf fi n granules [J]. J Biol Chem, 1978, 253 (8): 2858-2866.

[6]Naidu DG, Raha A, Chen XL, et al. Partial truncation of the NH2-terminus affects physical characteristics and membrane binding aggregation, and fusion properties of annexin A7 [J]. Biochim Biophy Acta, 2005, 1734(2): 152-168.

[7]Srivastava M, Montagna C, Leighton X, et al. Haploinsuf fi ciency Of Anx7 tumor suppressor gene and consequentgenomic instability promotes tumorigenesis in the Anx7 (+/-) mouse[J] PNAS, 2003, 100(24): 14287-14292.

[8]Hung KS, Hong SL. Prognostic significance of annexin Ⅶexpression in glioblastoms multiforme in humans[J]. Neurosurg 2003, 99(5): 886-892.

[9]李欣，陈雪，王小杰，等.膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌HeLa细胞系增殖与凋亡的影响[J].解剖学报，2010(4): 572-575.

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF ANNEXIN A7 IN GASTRIC CANCER

ZHANG Yang, XU Qian, CHEN Long, et al
(Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China)

Objective:To investigate the expression and significance of Annexin A7 in human gastric cancer.Methods:SP immunohistochemical staining and Western Blotting were respectively used to detect the expression of Annexin A7 in 55 cases gastric cancer and 25 cases para-carcinoma normal gastric tissue.Results:The Annexin A7 expression in gastric cancer was obviously higher than that in normal gastric tissue (P＜0.05).Conclusions:Annexin A7 may participate in the development of gastric cancer.

Annnexin A7; Gastric cancer; Tumor

R735.2

A

1004-6879(2014)03-0193-03

2013-10-10)

△ 通讯作者