软肝冲剂抗大鼠肝纤维化的实验研究

姜福义，章广玲

(1.河北联合大学，河北唐山 063000;2.承德医学院)

软肝冲剂抗大鼠肝纤维化的实验研究

姜福义1、2，章广玲1△

(1.河北联合大学，河北唐山 063000;2.承德医学院)

目的:探讨软肝冲剂对大鼠肝纤维化模型的治疗作用。方法:50只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、软肝冲剂低剂量组(4g/kg/d)、软肝冲剂高剂量组(8g/kg/d)和鳖甲软肝片组(0.8g/kg/d)，每组10只大鼠。40%四氯化碳和40%酒精灌胃制备大鼠肝纤维化模型，各用药组大鼠给予相应药物灌胃8周。分别检测各组大鼠的肝功能，肝纤维化指标层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)和肝组织羟脯氨酸(HYP)的含量。结果:软肝冲剂可明显改善肝纤维化大鼠模型的肝功能，降低LN、HA和肝组织HYP的含量;并且，软肝冲剂高剂量的效果明显优于软肝冲剂低剂量和鳖甲软肝片。结论:软肝冲剂对肝纤维化大鼠模型具有较好的治疗效果，但具体机制尚待进一步研究。

软肝冲剂;肝纤维化;肝功能;羟脯氨酸

肝损伤后细胞外基质沉积和降解失衡导致了肝纤维化[1]。目前，临床上尚无确切有效的逆转肝纤维化的药物。国内学者研究发现，许多传统中草药具有较好的抗肝纤维化疗效，如丹参、冬虫夏草、复方鳖甲软肝片等具有软坚散节、活血化瘀功效的单方、复方中药制剂，特别是中药组方多环节、多层次及多靶点的综合作用[2]。本研究建立大鼠肝纤维化模型，观察了不同剂量软肝冲剂作用的效果，以期为临床治疗肝纤维化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重180g±20g，由河北医科大学动物实验中心提供(合格证号:DK0410-0054)。软肝冲剂，白求恩国际和平医院制剂科配制;复方鳖甲软肝片，内蒙古集宁制药厂(批号:20120612)。层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)检测试剂盒，上海海军医学研究所。

1.2 实验动物分组和给药 随机选取10只大鼠作为正常对照组(A组);其余40只大鼠制备肝纤维化模型:40%四氯化碳(橄榄油稀释，2次/周)和40%酒精(1次/d)灌胃，20周后处死大鼠，以肉眼观察到肝硬化结节形成及镜下假小叶形成为模型诱导成功[3]。将成模大鼠随机分为4组，每组10只:模型组(B组)，软肝冲剂低剂量组(C组，4g/ kg/d)、软肝冲剂高剂量组(D组，8g/kg/d)，鳖甲软肝片组(E组，0.8g/kg/d)。C组、D组大鼠分别灌胃给予不同剂量的软肝冲剂8周，E组大鼠灌胃给予复方鳖甲软肝片8周，A组、B组大鼠灌胃给予等体积的生理盐水。

1.3 取材和指标检测

1.3.1 检测血液指标:各组大鼠用药结束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血后分离血清。①检测肝功能指标:于承德医学院附属医院检验科采用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和总胆红素(TBil)的含量。②肝纤维化指标:应用放射免疫法按照试剂盒说明进行操作检测LN和HA的含量。

1.3.2 检测肝组织羟脯氨酸(HYP)的含量:大鼠取血后断头处死，取肝组织冰浴下匀浆，采用胃酸酶解法测定不同浓度标准品和肝组织OD560值，制备标准曲线并计算每克肝组织HYP的含量[4]。

1.4 统计分析 采用SAS 8.0统计软件进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝功能检测结果 与模型组比较，各用药组大鼠肝功能指标不同程度得到改善(P＜0.01，P＜0.05);并且，软肝冲剂高剂量组的改善效果优于软肝冲剂低剂量组和复方鳖甲软肝片组。见表1。

表1 各组大鼠的肝功能(±s，n=10)

表1 各组大鼠的肝功能(±s，n=10)

与B组比较:aP＜0.01，bP＜0.05;与C组比较:cP＜0.01;与E组比较:dP＜0.05，eP＜0.01

组别 ALT(U/L) ALB(g/L) TBil(μmol/L) A组 24.3±7.4a 39.3±1.9a 17.2±2.9bB组 193.2±25.0 35.2±1.7 22.9±6.6 C组 130.5±21.7a 36.7±1.6 18.1±3.2bD组 99.7±21.4acd 40.3±2.3ace 15.4±3.3aE组 125.4±21.5a 36.3±1.7 18.6±3.6b

2.2 大鼠肝纤维化指标检测结果 与模型组比较，各用药组大鼠HA、LN的含量明显降低(P＜0.01);并且，软肝冲剂高剂量的效果优于软肝冲剂低剂量和复方鳖甲软肝片。见表2。

表2 各组大鼠肝纤维化指标检测结果和肝组织HYP的含量(±s，n=10)

表2 各组大鼠肝纤维化指标检测结果和肝组织HYP的含量(±s，n=10)

与B组比较:aP＜0.01;与D组比较:bP＜0.01;与E组比较:cP＜0.01，dP＜0.05

组别 HA(ng/ml) LN(ng/ml) HYP(☒g/g肝组织) A组 116.3±11.9a 106.9±8.8a 13.9±2.6aB组 1022.3±62.6 796.9±55.4 115.6±8.7 C组 726.3±36.9ab 310.3±21.9abc 56.9±6.8abdD组 485.6±49.5ac 228.9±29.6ac 35.1±3.1acE组 729.8±79.0a 513.0±24.9a 62.5±3.3a

2.3 大鼠肝组织HYP的含量 与模型组比较，各用药组大鼠肝组织HYP的含量明显降低(P＜0.01);并且，软肝冲剂高剂量的效果优于软肝冲剂低剂量和复方鳖甲软肝片。见表2。

3 讨论

软肝冲剂由丹参、黄芪、当归、桃仁、党参、栀子、黄芪、茵陈等10余味中药组成，具有活血软坚、化痰除湿的功效。其中，丹参在临床以及实验研究中均被证实有较明确的抗肝纤维化作用，机制可能与其阻断肝脏Kupffer细胞和肝星形细胞活化、下调细胞因子表达、减少胶原蛋白合成及促进自由基清除等多方面的作用有关[5]。黄芪具有补中益气、升阳固表等功效，实验研究发现，黄芪可明显减少总胶原及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原在大鼠肝脏的病理性沉积，降低胶原蛋白含量，逆转肝纤维化[6];体外实验也发现，黄芪可明显抑制体外激活的肝星形细胞的增殖和胶原的产生[7];临床应用黄芪注射液可以明显改善肝纤维化[8]。另外，当归可活血补血;桃仁散瘀结积聚，对实验性肝损害和中毒性肝炎，有保护肝细胞和恢复肝功能的作用，并可防止肝糖原降低，对体外培养肝细胞DNA、RNA的合成有促进作用[9];菌陈可减轻肝细胞肿胀、变性和坏死的程度，对实验性肝损伤有保护作用[10]。

中医学认为肝纤维化属于“瘤”、“痹”、“痞”、“积”等范畴，痰瘀互结致使全身气、血、津液运行不畅，阴阳失调，严重时导致肝硬化。软肝冲剂根据辨证论治理论，以及单味药物抗肝纤维化的各种分子机制，应用10余味药物组方，应用于大鼠肝纤维化模型，并与传统抗肝纤维化药物鳖甲软肝片比较，从肝功能和纤维化指标等多方面证实，软肝冲剂能改善大鼠肝功能，降低HA、LN以及肝组织HYP的含量，疗效不仅优于鳖甲软肝片，且随着治疗剂量的增大，治疗效果更明显。因此提示，软肝冲剂对大鼠肝纤维化模型治疗效果明确，但其具体抗肝纤维化的机制还有待进一步深入研究。

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[4]Okuyama H, Nakamura H, Shimahara Y, et al. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide- induced hepatic fi brosis inmice [J]. J Hepatol, 2005, 42(1):117-123.

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[10]仲雨，秦明珠.茵陈大孔树脂提取物对CCl4所致肝损伤的影响[J].安徽医药，2007，11(1):13-14.

(基础医学栏目编辑:陈志宏)

EXPERIMENTAL STUDY OF RUANGANCHONGJI ON LIVER FIBROSIS IN RATS

JIANG Fu-yi, ZHANG Guang-ling
(Hebei Union University, Hebei Tangshan 063000, China)

Objective: To explore the therapeutic effects of Ruanganchongji on rat liver fi brosis model.Methods:50 male Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, Ruanganchongji low dose group (4g/kg/d), Ruanganchongji high dose group (8g/kg/d) and Biejiaruanganpian group (0.8g/kg/d), with 10 rats in each group. The rat liver fi brosis model was established by lavaging 40% carbon tetrachloride and 40% alcohol; then the rats in each drug group were lavaged with corresponding drugs for 8-week. The liver function, liver fi brosis indexes (laminin and hyaluronic acid) and hydroxyproline content in liver were respectively detected.Results:Ruanganchongji could improve the liver function of liver fi brosis rat model; reduce the content of laminin, hyaluronic acid, and hydroxyproline content in liver obviously. Moreover, the effects of Ruanganchongji high dose were better than Ruanganchongji low dose and Biejiaruanganpian.Conclusions:Ruanganchongji has better therapeutic effects on liver fi brosis model rats, but the mechanisms need further study.

Ruanganchongji; Liver fi brosis; Liver function; Hydroxyproline

R575.2

A

1004-6879(2014)03-0200-03

2013-09-30)

△ 通讯作者